药物洗脱支架的微粒疲劳耐久性测试方法研究

段青姣 焦永哲 董双鹏 马金竹 国家药品监督管理局无源植入器械重点实验室 （天津 300384）

内容提要： 对药物洗脱支架在疲劳耐久性测试时的微粒脱落进行了初步研究，测试条件模拟人体血管生理环境，将支架放入模拟血管，测试液体为（37±2）°C的磷酸盐缓冲液，测试频率为6Hz，进行了960万次加速疲劳试验，在疲劳测试过程中实时测试微粒脱落的数量及大小。并总结了试验过程中需要注意的问题，可为各医疗器械检测机构及生产企业提供参考。

随着人口老龄化的加剧，心血管疾病的发病率呈逐年上升趋势。冠状动脉易出现粥样硬化，使血管腔变得狭窄，甚至被阻塞，从而造成心肌缺血缺氧，时间过久便会发生心肌坏死，严重威胁到患者的生命安全。药物洗脱支架已成为治疗心血管疾病的重要手段。药物洗脱支架是把抑制细胞增生的药物涂在支架上，使药物可以在支架植入后的3个月左右慢慢释放，保持支架的畅通，避免发生再狭窄。药物洗脱支架的再狭窄率只有5%～10%，明显改善了冠心病患者的远期预后。

微粒是一种在人体中不能代谢的不溶性颗粒，其可能有多种来源，包括医疗器械材料本身、环境和临床使用。药物洗脱支架除了生产过程中会引入外来微粒，在使用过程穿越、扩张等操作也会导致药物涂层脱落，微粒进入血液循环后，会对人体产生损害，支架植入人体后，在人体血流作用下周期性地收缩扩张，也会加速支架上微粒脱落。微粒容易引发血栓的形成而导致病情恶化或引起新的疾病，微粒进入人体血液循环后可能引发炎症反应、肉芽肿、血管栓塞、热原反应甚至恶性肿瘤等危害[1-5]。各国药典均有对注射液微粒的限量要求，一次性医疗器械输液器具的微粒污染已经得到广泛研究。

目前，国内医疗器械行业有关器械微粒的评估，主要参照有《中华人民共和国药典》对注射液微粒的要求、国家标准GB 8368-2018中对一次性使用输液器微粒污染指数的要求、GB/T 19335-2022中对一次性使用血路产品的微粒含量要求、行业标准YY/T 1556-2017中对医用输液、输血、注射器具微粒污染检验方法的要求等，微粒的允许限量取决于多种因素，包括化学成分、潜在毒性、形状和大小等[6-8]。现阶段，国内外尚无专门针对血管支架产品微粒控制的统一标准，目前普遍沿用了各国药典中对小规格注射液的标准：每个供试品含10μm以上的微粒不得超过6000粒，含25μm以上的微粒不得超过600粒[9]。有关药物洗脱血管支架的微粒测试方法，目前开展的主要是即刻微粒测试，包括基线测试和模拟使用测试，基线测试是指支架在无约束的水浴中扩张，进而收集支架即刻产生的微粒数量，模拟使用测试是支架模拟临床使用，在37°C水浴中，支架系统通过血管模型后，进行涂层检查和即刻微粒表征。这两种方法都只能表征支架即刻产生的微粒，支架植入人体后将长期存在，有必要对支架长期微粒脱落情况建立测试方法，目前国内有关药物洗脱支架的微粒疲劳耐久性测试研究鲜有人开展。本文模拟人体生理环境，在PBS缓冲液中对药物支架进行了960万次（等效92.6d）的加速疲劳测试，对支架的微粒脱落进行了初步研究。本文提到的方法有助于建立药物洗脱支架的长期微粒测试方法。

1.材料与方法

1.1 一般材料

试样和装置：试验样品为某公司提供的药物洗脱支架，材质为钴铬钼合金，输送系统为与支架匹配的球囊扩张导管。试验液体为磷酸盐（PBS）缓冲盐溶液，试验温度（37±2）°C。模拟血管为顺应性乳胶管。壁厚0.30mm，内径约3.5mm。

仪器设备：采用的疲劳测试装置为Dynatek公司的微粒疲劳试验机。

1.2 方法

1.2.1 试验原理

微粒疲劳测试设备在单个波纹管上利用了电磁驱动产生循环压缩。波形信号的调节使每个循环充入测试样品中的测试溶液体积发生改变，同时引起设备径向扩张的变化。闭环控制使液体流入近端多路管路，在多路管路处被独立分开至5个单独的测试样品中，并将脱落的颗粒冲刷至粒子计数器中。在流过粒子计数器后，流体通过单独的流量计，以调节通过样品的流体速度。在通过流量计之后，流体汇聚到一根管路并在回到近端管路和测试样品之前依次经过电容箱、液体泵和0.2μm的滤芯。测试溶液在电容箱内进行加热，液体温度在近端管路中监控。微粒疲劳测试设备的系统软件控制测试压力，并通过电容箱的增压保持系统内的压力稳定。测试频率、试验温度、循环周期计数、测试压力及粒子数量等参数可通过微粒疲劳测试设备软件进行监控和实时记录。粒子数量由粒子计数器持续监测，并由软件定期进行记录。粒子以尺寸大小区分，并根据需要的尺寸范围将原始计数记录到记录器中。

1.2.2 试验过程所有测试过程必须在受控的环境下（即不影响研究的完整性的环境）进行测试，这是极为重要的，本试验对环境要求较高，应尽可能在洁净间中进行，以防止测试过程中产生的微粒污染。环境污染对药物支架脱落的微粒形态，大小和数量具有显著影响。同样，也可能会对支架表面造成污染，最终被误认为是涂层的缺陷，影响正确的判断。试验人员应穿着合适的衣服（例如，发网、不脱落的聚酯外套和无颗粒手套），以降低颗粒污染的风险。所有器械评估中使用的耗材应不含污染物。玻璃器皿应用洗涤剂溶液洗涤，然后使用无颗粒或过滤液彻底冲洗。试验开始前，设备需要更换新的0.2μm的过滤器，保证管路洁净，用试验用水彻底清洁微粒测试系统，这是为了保证系统中空白的微粒在较低水平，以使添加的任何水平的外来微粒对测试结果的影响都可以忽略不计。

待系统冲洗干净，加入PBS缓冲盐溶液，更换验证管进行微粒验证。应对测试系统的每个通道的微粒回收率进行验证。微粒回收率应在没有安装支架的情况下进行。微粒的均匀分布以及注射体积精确与否对验证微粒回收率至关重要。注入微粒前，应保证摇匀验证微粒，然后将微粒吸入注射器，排出注射器中所有气泡，注入时，避免管道里引入任何气泡，进行一次或多次注射，因为这代表了粒子捕获效率最差的情况。测试期间回收的微粒数量应达到预先规定的水平。微粒计数器的准确性可以通过标准微粒进行验证，建议回收的颗粒在≥10μm和≥25μm尺寸范围内满足≥90%回收率。量化的最大颗粒尺寸满足≥75%回收率，建议最大尺寸至少为≥50μm[10]。

验证完成后，更换测试用的顺应性模拟血管，运行空白溶液至微粒较低水平，并持续一段时间。测试模拟血管的顺应性，其顺应性宜控制在3%～5%。根据产品使用说明书，将支架用球囊输送系统输送到模拟血管中心部位，这个过程应在洁净平台进行，将装有支架的模拟血管安装到疲劳机的接头上，开启温控系统，调整温度到（37±2）°C，将疲劳试验机的频率调到1.2Hz，压力80～160mmHg，用激光测量仪测量模拟血管（有支架部位）的平均直径和直径变化量，调节试验频率为6Hz，并调节设备使模拟血管（有支架部位）达到目标直径及直径变形量，排出系统中所有气泡，开始测试。

经过960万次的加速疲劳测试后，拆除模拟血管，先用低倍放大镜观察支架表面是否损坏，然后用光学显微镜放大观察支架，检查支架表面是否有结构损伤。

1.2.3 试验过程中需要注意的问题

试验液体为PBS缓冲盐，应保证配制的缓冲盐溶解完全，可先用0.45μm滤膜过滤，人体的生理温度下盐类介质很容易滋生细菌，所以试验开始前有必要加入适当的抑菌剂，以避免系统长菌。上文提到过，排除系统中的气泡至关重要，本文中的微粒计数法为光阻法，系统中产生的微小气泡可能会作为微粒被统计，所以应尽可能地排出系统中的所有气泡，加热有利于气泡的排出，安装支架前轻拍管子也有利于赶出气泡。由于流量过大或者过小都会影响到微粒的计数，应每天观察流量计的读数，使设备的流量维持在100mL/min。当验证完成后，不要立即更换测试用的模拟血管，应运行空白溶液直至微粒降低到较低水平，以避免系统中残留的验证粒子污染测试管，更换测试管后，继续运行空白溶液至微粒在可接受水平，此时再将支架安装到模拟血管。这个过程可能要持续一周或更长的时间，这是为了保证系统中的空白足够干净，以对试验结果的影响降到最低。

2.结果

2.1 支架长期微粒测试结果

由于测试开始时安装支架会引入大量气泡，对空白通道10～25μm粒径的微粒进行分析，发现从循环周期175814开始，空白通道微粒基本达到稳定（见图1），经过960万次循环的加速疲劳试验，每个测试样品总微粒数及空白通道总微粒数见下表1和表2。

表1 .测试样品总微粒数(包含空白)（粒）

表2 测试样品总微粒数(扣除空白)（粒）

图1 .空白通道10～25μm 的实时微粒数量（粒）

图2～5是样品及空白通道测试期间实时微粒数与总微粒数。由此可见扣除空白后，样品在长期的疲劳耐久测试中脱落的微粒数量在较低的水平，对支架表面放大观察的结果也证明了这一点。

图2 .空白通道实时微粒数量（粒）

图3 .空白通道总微粒数量（粒）

图4 .样品实时微粒数量（粒）

图5 .样品总微粒数量（粒）

测试到的微粒可能来自盐结晶、气泡、产品脱落等，可对每个通道上安装的过滤膜取出做进一步表征，本文未作进一步分析。

2.2 支架即刻模拟使用微粒测试结果

根据说明书准备支架系统和所有配件，将模拟穿越装置放置在（37±2）°C的水浴中，按照使用说明书建议使用各种辅助器械（例如，导引导管、导丝、导引鞘）操作，在血管模型中进行穿越、扩张、回撤支架系统或球囊扩张导管，扩张压力首选额定爆破压。模拟使用过程中的跟踪应通过模型弯曲路径，该路径模拟临床使用过程中支架系统通过的具有代表性的血管几何构型。血管模型可以由玻璃或其他耐用的非颗粒脱落材料制成，从而最大限度地减少背景颗粒计数。血管模型需浸没在水浴中，扩张后的支架应紧贴血管模型壁，待支架完全释放后，撤出。用足够的水冲洗导管、模拟穿越装置和支架放入的血管模型，收集释放的微粒，确保微粒已全部收集。在冲洗时注意不要损坏涂层。应注意不要引入任何可能影响研究结果的气泡或其他污染物。应避免使用保留气泡或可能产生气泡的溶液进行分析，样品可以放置一段时间以便对样品进行脱气，但应混合均匀（如搅拌、倒置、滚动、旋转），以确保颗粒悬浮在样品中。同时应考虑和控制混合的时间、方法和速率，以便在保持颗粒悬浮液均匀的情况下最大限度地减少颗粒结块或破碎。将支架从血管模型中取出，注意不要损坏支架涂层。收集或连续监测从支架的涂层、支架系统和相关配件在整个释放过程中累积的颗粒物，并按照颗粒的大小和范围进行分类。对微粒进行分类是必要的，可以帮助区分微粒的来源，测试结果见表3。

3.讨论

目前微粒测试的方法主要有光阻法和显微镜法，这两种方法各有其优缺点，光阻法的优势是速度快，可以对微粒进行100%的计数，而且能够根据微粒大小进行分类计数。缺点是不能表征微粒的组成，不能识别具有气泡和润滑剂的人工制品，而且如果有阴影干扰可能会将微粒遗漏，其对非球形微粒的粒径辨别不准确，对大粒径的微粒识别有限制。显微镜法的优势在于可以通过微粒的颜色和外观判别来源，而且对气泡和润滑剂不敏感。其缺点是详细分析耗时且需要使用计算软件，存在抽样误差，微粒的聚集会造成计数和粒径的判别失误，设备不能对样品进行处理（例如，从烧杯转移到过滤器，从过滤器转移到显微镜），对图像分析软件需要验证，人工计数的重复性和再现性差[11]。例如，若微粒中有纤维存在，由于其三个维度不同，（纤维定义为纵横比为≥10:1），光阻法计数可能无法区分纤维，应使用显微镜检查来表征支架上脱落的颗粒形状，以确保颗粒物计数方法的适当性。本文中设备中的计数方法为光阻法，而滤膜上的微粒测试则需要使用显微镜法计数。

综上，支架长期微粒测试时影响因素众多，安装支架时引入的大量气泡应排除，此段时间产生的微粒数量及大小可通过滤膜上的微粒用显微镜法进行测试，也可以通过支架即刻模拟使用测试进行表征，对于微粒长期测试开始的时间点，本文是通过空白通道微粒趋于稳定的时间来确定，空白通道也便于排除非颗粒物（如气泡）等的影响，由于磷酸盐生理环境下极易长菌，测试开始后，应注意测试液有必要加入抑菌剂。试验中产生的微粒可通过取出过滤膜进一步研究，通过对微粒材料的化学性质进行鉴定，可以将微粒的来源进行区分，确认微粒是否属于支架系统自身产生。在研究和表征颗粒物的潜在来源时，颗粒的化学成分可能是一个重要的考虑因素。考虑到器械适用的血管区域，颗粒的尺寸大小同样重要，应明确被测试微粒的尺寸范围（通常为三个或更多），以量化落入这些指定分组的颗粒数量。颗粒物的化学鉴定可采用傅里叶变换红外光谱、X射线光谱、扫描电子显微镜、荧光显微镜、拉曼光谱等方法进行。

本文对药物洗脱支架在疲劳耐久性测试时的微粒脱落进行了初步研究，并总结了试验过程中需要注意的问题，国内相关研究开展较少，本研究可为各医疗器械检测机构及生产企业提供参考。而如何确定微粒的来源，评估微粒的临床风险，以及如何确定器械产品的微粒限值问题，还有待进一步深入研究。