围产期相关激素对奶牛中性粒细胞功能调控及其与免疫抑制的相关性分析

贺显晶，郭东华，连帅，武瑞，王建发

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆 163319；2.佳木斯大学）

中性粒细胞（Poly-morphonuclear Neutrophils，PMNs）是机体抵抗病原体侵入的重要防线，在奶牛乳腺、子宫、肺脏等组织天然免疫反应过程中具有重要防御作用。乳腺炎、子宫内膜炎和肺炎是奶牛最常见的由病原菌感染导致的炎症疾病。发生感染时，细菌表面的病原体相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）可以作为配体被靶组织上皮细胞和巨噬细胞表面的模式识别受体（Pattern recognition receptor，PRRs），如Toll 样受体（Toll like receptors，TLRs）等所识别，上调核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）的DNA 结合活性，提高炎性细胞因子和趋化因子的表达量，进而促进中性粒细胞向炎症部位的聚集、黏附和移行[1-4]。一般情况下，中性粒细胞进入乳腺腺泡腔、子宫腔或肺泡腔后，可通过吞噬作用、呼吸爆发和形成胞外诱捕网（Neutrophil extracellular traps，NETs）来杀灭病原菌，并转归凋亡，保障奶牛健康[5]。可见，中性粒细胞在奶牛乳腺炎、子宫内膜炎和肺炎等炎症性疾病发生发展过程中具有不可替代的关键作用。

围产期奶牛要经历妊娠、分娩和泌乳等生理过程，激素分泌模式和营养代谢模式均发生剧烈变化，可导致围产期奶牛先天性和获得性免疫功能显著降低[6]。其中，中性粒细胞天然免疫功能低下是导致围产期奶牛乳房炎、子宫炎等疾病高发的重要原因[7]。在奶牛中性粒细胞天然免疫功能低下致病因素方面，围产期奶牛营养代谢模式的改变如高脂血症、低钙血症、高酮血症等对中性粒细胞功能表型的影响关注度较高。由于围产期奶牛生殖激素（雌二醇等）、应激激素（皮质醇等）、泌乳激素（催乳素等）、代谢激素（胰高血糖素等）等变化明显，这些激素是否对中性粒细胞功能表型有调控作用及相关作用途径尚未完全明确。因此，深入揭示围产期相关激素在中性粒细胞活化、趋化黏附、跨膜迁移、呼吸爆发、吞噬杀菌和胞外诱捕网形成等不同功能中发挥重要的作用，将为全面认识围产期奶牛免疫抑制的形成机制、有效保障围产期奶牛健康提供研究基础和决策参考，对保障畜牧养殖业的持续健康发展具有重要的科学价值和应用前景。

1 奶牛体内中性粒细胞生物功能及其调控因素研究进展

当病原微生物入侵奶牛机体靶组织时，中性粒细胞向感染部位迁移，其募集过程主要分为活化、滚动、黏附、变形和移出等步骤（表1）[1-4]。中性粒细胞进入奶牛乳腺腺泡腔/子宫腔/肺泡腔后，可通过吞噬作用、呼吸爆发和形成胞外诱捕网来杀灭病原菌[2-4]。中性粒细胞跨血管内皮细胞、乳腺上皮细胞/子宫内膜上皮细胞/肺泡上皮细胞迁移功能、胞外诱捕网形成功能、对病原菌的吞噬活性和呼吸爆发功能决定了奶牛乳腺炎、子宫内膜炎和肺炎等奶牛炎症性疾病的发展转归。中性粒细胞活化、趋化黏附和跨膜迁移功能调控因素相关研究发现，预先用氯膦酸脂质体（一种巨噬细胞凋亡诱导药物）耗竭小鼠体内的巨噬细胞，再向其乳腺中灌注脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）不能引起中性粒细胞向乳腺腺泡迁移；向敲除TNF-α 或IL-1β 受体基因的小鼠乳腺内灌注LPS 也不能引起中性粒细胞向乳腺腺泡迁移；但向血液中或乳腺组织内预先负载外源野生型小鼠巨噬细胞，LPS 可重新诱导中性粒细胞向乳腺腺泡迁移[8]。可见，巨噬细胞分泌的促炎细胞因子在调控中性粒细胞定向迁移过程中发挥了重要的活化作用。中性粒细胞趋化过程主要受趋化分子8（CXCL8）、补体C5a、白三烯B4（Leukotriene B4，LTB4）、血小板活化因子（Platelet activating factor，PAF）等调控[2]。L-选择素又称CD62L，其表达升高或脱落可介导中性粒细胞在血管内皮中的滚动；β2-整合素又称CD11b/CD18，可与细胞间黏附分子-1（ICAM-1）结合，介导中性粒细胞的紧密黏附过程；血小板内皮细胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule -1，PECAM-1）主要表达于单核细胞和中性粒细胞表面，可介导中性粒细胞的移出[9]。向隐性乳房炎患病牛乳腺内灌注重组牛粒细胞集落刺激因子，可降低中性粒细胞表面黏附分子表达水平，进而降低乳汁中体细胞数[9]。同时，激光辐照大鼠乳腺后可改变毛细血管血液流变学特征，减少中性粒细胞与血管内皮细胞的黏附，进而降低乳腺腺泡腔内中性粒细胞数量[10]。所以，中性粒细胞跨内皮/上皮迁移过程也受上述黏附分子调控。

中性粒细胞呼吸爆发、吞噬杀菌和NETs 形成调控因素相关研究中，发现动物遭受细菌感染后，中性粒细胞表面的Fc 受体和C3b 可以识别并结合包裹在细菌表面的抗体或补体，使细菌黏附在中性粒细胞上，之后中性粒细胞伸出伪足包裹细菌并形成吞噬体，吞噬体进入中性粒细胞内部后与初级溶酶体融合，形成吞噬溶酶体[4]。进入吞噬溶酶体的细菌主要被具有活性的氧化代谢产物杀伤（呼吸爆发），在此过程中髓过氧化物酶（Myeloperoxidase，MPO）利用过氧化氢和氯离子产生次氯酸盐，并形成具有氧化能力的自由基。氧自由基、次氯酸盐可通过氧化细菌菌体蛋白、破坏细菌细胞壁来杀灭细菌[11]。NETs 由DNA 纤维网、组蛋白和颗粒蛋白构成，其形成需要依赖于肽酰基精氨酸脱亚胺酶4（Peptidylarginine deiminases 4，PAD4），PAD4 一旦活化，细胞内组蛋白即可转变成瓜氨酸化组蛋白，使染色质解螺旋形成疏松网状结构[11]。此外，应用NADPH 氧化酶抑制剂二联苯碘及NADPH 缺陷小鼠开展研究证实活性氧在NETs 形成中具有重要作用[3，11]。可见，影响中性粒细胞吞噬作用、呼吸爆发和NETs 形成的关键因素分别是Fc 受体和补体C3b 表达水平、MPO 活性和PAD4 活性。

中性粒细胞凋亡在炎症反应消退过程中起到重要作用，PMN 凋亡对奶牛乳腺健康十分重要，延缓中性粒细胞凋亡对乳腺感染的早期有利，而中性粒细胞凋亡的加速又有助于病原体的清除，同时，活化的PMN 及产物对奶牛乳腺组织产生损伤。正常生理条件下，奶牛中性粒细胞具有相对较短的半衰期和自发承受细胞凋亡的能力，同时奶牛中性粒细胞凋亡受泌乳阶段的影响，泌乳早期较泌乳中期奶牛中性粒细胞有更高的细胞凋亡[12]。奶牛乳腺感染后，病原微生物产物及促炎性细胞因子对中性粒细胞凋亡起到促进或延缓作用，如IL-1β，IL-6，IL-8 等细胞因子对炎症具有正调节作用，能延长中性粒细胞生存期[13-14]。如TNF-α 等能诱导牛中性粒细胞凋亡。LPS、白细胞毒素及溶血素等细菌产物在一定程度上能抑制中性粒细胞产生细胞凋亡。

2 围产期奶牛中性粒细胞天然免疫功能低下发生因素研究进展

关于围产期奶牛中性粒细胞天然免疫功能的研究较多，但研究结论不尽一致。有研究指出，围产期奶牛中性粒细胞天然免疫功能变化主要表现为MPO活性、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（Antibodydependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、趋化活性、跨膜迁移和吞噬功能减弱[2，15]。但也有研究报道，围产期奶牛中性粒细胞趋化活性未见明显改变，吞噬功能增强[16]。此外，多项关于围产期奶牛中性粒细胞氧自由基（Reactive oxygen species，ROS） 产生、PRRs 表达、促炎细胞因子产生的研究报道也存在结论不一致的现象[2]。因此，有必要全面系统的检测围产期奶牛中性粒细胞功能表型及其生物标志分子变化情况，完整描述围产期奶牛中性粒细胞功能特征变化。

营养代谢模式和激素分泌模式变化是导致围产期奶牛中性粒细胞天然免疫功能低下的重要因素[2，12]。围产期奶牛营养代谢模式变化主要包括高酮血症、高脂血症、低钙血症和低血糖症[2，17-19]。围产期奶牛，特别是产后奶牛由于泌乳量增加，而干物质摄入量受生殖激素影响却不能同步提高，导致机体处于能量负平衡状态。处于能量负平衡状态的围产期奶牛，为缓解能量负平衡，其体内脂肪组织动员增加。Zerbe 等[20]在研究围产期奶牛肝脏三酰甘油的含量与PMN 的免疫功能之间的关系时，发现提高产后第1 周和第2 周肝脏三酰甘油的含量与来自血液和子宫的PMN 功能降低有关。通过调查围产期奶牛外周血中性粒细胞功能、能量状态和子宫健康之间的相关性发现：围产期奶牛子宫健康与血液中性粒细胞功能和能量平衡直接相关，中性粒细胞功能受损和能量负平衡的发生多见于奶牛分娩或子宫炎症性疾病前[21]。奶牛血液中β-羟丁酸（β-hydroxybutyric acid，BHBA）浓度升高可减弱中性粒细胞趋化、呼吸爆发、吞噬和NETs 形成功能[2，22]；但也有研究指出，改变血液中BHBA 浓度后，奶牛中性粒细胞呼吸爆发功能未受影响[2]。血液中非酯化脂肪酸（nonesterifiedfatty acid，NEFA）浓度升高奶牛中性粒细胞MPO活性降低，中性粒细胞诱导的呼吸爆发功能下降，趋化功能和吞噬功能呈增强的趋势[16]。体外研究发现，生理浓度的NEFA 能提高中性粒细胞呼吸爆发功能，超生理高浓度的NEFA 可导致中性粒细胞坏死，但对中性粒细胞凋亡水平和吞噬功能无影响[2]。高浓度的NEFAs 和BHBA 能上调中性粒细胞TLR2 和TLR4，激活NF-κB 信号通路，促进中性粒细胞炎性因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的合成和释放，引起奶牛中性粒细胞炎性损伤，从而导致酮病奶牛免疫功能低下[23]。

围产期奶牛高脂血症和高酮血症频发，高脂血症和高酮血症均可以引起围产期奶牛中性粒细胞功能下降，进而导致围产期奶牛炎症性疾病高发。酮病奶牛的高酮血症能诱导中性粒细胞NETs 的形成，其中BHBA 通过GPR109A-mTOR 信号通路诱导奶牛中性粒细胞自噬，继而调节NETs 产生，且BHBA 诱导的奶牛中性粒细胞NETs 不依赖于ROS。同时，高浓度的BHBA 通过PKC-MLC2 信号传导的激活抑制中性粒细胞迁移[22]。钙离子在免疫细胞分化、生长、激活中具有重要作用，被称为“启动免疫系统的开关”[24]，低钙血症患牛中性粒细胞比例降低，其趋化、迁移、黏附吞噬功能和呼吸爆发等功能降低[15，25]，线粒体损伤，进而引起ROS 含量下降，进一步加剧奶牛中性粒细胞损伤[26]。低钙血症患病牛中性粒细胞表面ORAⅠ1降低，引起中性粒细胞不能摄取钙离子，导致中性粒细胞功能受损，血浆中PTH 和1，25（OH）2D3可以通过影响ORAⅠ1 表达参与调控中性粒细胞活性[27，28]。单纯的血糖降低对奶牛中性粒细胞功能影响较小，但泌乳早期奶牛补充葡萄糖可以缓慢提高中性粒细胞吞噬功能和溶菌酶表达水平，而对其趋化功能、肿瘤坏死因子-α 表达水平和细胞结构无显著影响[19，29]。由此可见，围产期奶牛营养代谢模式变化对中性粒细胞功能表型的影响及作用机制研究已成为国内外相关研究的热点问题。

3 围产期相关激素对奶牛中性粒细胞生物功能调控研究进展

围产期是奶牛生产周期中的一个特殊又重要的生理时期，据报道乳热、真胃变位、脂肪肝综合征和酮病等代谢紊乱性疾病，乳腺炎和乳房水肿等乳腺感染性疾病和难产、胎盘不下和子宫感染等生殖障碍性疾病在高产奶牛中发病率分别为7.8%～16.8%，2.8%～12.6%和6.7%～19.2%。因此，围产期奶牛因免疫抑制而引起的亚急性炎症疾病已经给畜牧养殖业造成严重经济损失，深入开展其致病机理的研究具有重要的现实意义。围产期奶牛的各种生理活动引起多种激素浓度变化。在妊娠大部分时期，激素分泌水平处于平稳状态，直到妊娠后期，激素分泌水平发生剧烈的变化以期应对分娩及泌乳等重要生理活动，激素分泌模式的剧烈变化对围产期奶牛生殖活动和代谢过程具有重要的调节作用。围产期的奶牛激素分泌模式变化主要包括生殖激素分泌水平改变（雌二醇在分娩后迅速升高、孕酮迅速降低）、应激激素分泌水平改变（皮质醇、促肾上腺皮质激素在分娩时迅速升高）、泌乳激素分泌水平改变（催乳素、生长激素在泌乳初期迅速升高，甲状腺素在分娩前下降分娩后升高）和代谢激素分泌水平改变（胰高血糖素、胰岛素在分娩前迅速降低）[2，15，17，29-30]。雌二醇和孕酮是奶牛发育和生殖阶段最主要的生殖激素，对奶牛妊娠和维持妊娠具有重要作用。早期研究发现，乳腺的免疫功能受生殖激素调控，雌二醇和孕酮对非特异免疫具有调节作用[31]。Abid[32]发现雌二醇处理去卵巢雌性小鼠后，小鼠血液中性粒细胞的氧化爆发功能增强，且接种铜绿假单胞菌后小鼠死亡率降低。同时，经雌二醇处理感染化脓杆菌的卵巢切除奶牛无子宫炎的发生，而经黄体酮处理后奶牛仍然有不同程度的炎症[33]。体外研究显示，雌二醇对中性粒细胞跨上皮迁移能力具有抑制作用，对中性粒细胞NETs形成具有促进作用，推测其可能途径是雌二醇与奶牛血液中中性粒细胞的ER 受体结合引起[34-35]。孕酮对中性粒细胞的跨上皮迁移能力具有促进作用，对奶牛中性粒细胞形成NETs 无影响；而催乳素对中性粒细胞趋化功能具有抑制作用，催乳素和胰岛素体外对PMN 迁移功能无调控作用[36]。同时围产期奶牛疾病易感性与奶牛免疫抑制有关，奶牛产后中性粒细胞功能降低是导致免疫抑制的诱发因素，围产期激素如雌二醇等的剧烈变化可能是导致奶牛围产期疾病易发的原因[37]。因此，正确认识围产期激素分泌波动变化和奶牛中性粒细胞功能的关系对防控奶牛炎症性疾病具有重要意义。

围产期奶牛激素分泌模式通过在体实验和体外实验影响中性粒细胞趋化、迁移、呼吸爆发等生物学功能。在体研究发现，雌二醇可以降低奶牛中性粒细胞趋化功能和迁移活性，但不影响其呼吸爆发功能[2]；孕酮对奶牛中性粒细胞趋化功能、迁移活性和呼吸爆发功能均无明显影响[2]；血清皮质醇浓度与奶牛中性粒细胞Fas 基因表达水平下降存在关联性[37]；体外研究发现，胰岛素不具有调控奶牛中性粒细胞生物功能的作用，但2，4-噻唑啉二酮（TZD，一种II 型糖尿病治疗药物）可以调控奶牛中性粒细胞超氧化物阴离子生成量、抑制ROS 生成，但对其吞噬功能和NETs 形成能力无明显影响[33，38]。促肾上腺皮质激素（Adrenocorticotropic Hormone，ACTH）在药理学浓度或生理学浓度下，能够引起从乳汁中分离出来的PMN 对金黄色葡萄球菌的吞噬活性降低[39]。除此以外，其它围产期相关激素对奶牛中性粒细胞其它功能表型的影响及作用途径尚需进一步明确。

4 展望

围产期作为奶牛疾病的高发期，高酮血症、高脂血症、低钙血症、低血糖症等营养代谢模式改变直接导致奶牛血液中性粒细胞天然免疫功能低下，进而引起奶牛易患奶牛乳腺炎、子宫内膜炎和肺炎等炎症性疾病，以往研究多关注于营养水平对中性粒细胞功能表型的影响及作用机制研究，并已取得一系列重要进展。妊娠末期，奶牛生殖相关激素分泌模式变化明显，哪些激素通过何种途径影响了中性粒细胞的哪类生物功能尚未得到明确阐述。围绕这一科学问题，明确围产期相关激素对中性粒细胞不同功能表型的影响及相关调控机制，将为全面认识围产期奶牛免疫抑制的形成机制、有效保障围产期奶牛健康提供研究基础和决策参考。