车前草总黄酮提取工艺优化及其抗腹泻活性的研究

李璐，邢晓旭，朱庆贺，王俊，李梓健，赵飞宇，赵鹏宇，孙东波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319）

腹泻是一种由多种非感染或感染类因素引起的胃肠道疾病，其特征为频繁水样便和腹痛，甚至死亡[1]。腹泻也是全球养猪业面临的严重问题之一，据报道，每年死于腹泻的仔猪比例超过50%，已经严重影响畜牧业的发展[2]。目前，对于腹泻的治疗并没有特效药进行治疗，临床多以抗生素并加以补液治疗，然而，随着细菌耐药性增强问题不断出现，对治疗腹泻的效果并不显著，加上“减抗替抗”等相关政策的实施，寻找新型、安全、高效的天然抗腹泻药物对预防、控制动物腹泻的发生以及降低畜牧业经济损失具有重要意义。

车前草（Plantago asiatica L），为车前科（Plantaginaceae）车前属（Plantago）植物，种子和整株草都可以作为药物对相关疾病进行治疗，是一种中国传统中草药，该植物在亚洲大部分地区都有分布[3-4]。车前草（车前属）在传统医学中被广泛使用，其中一些也被现代医学所接受。车前草富含多种活性成分，这些成分有助于发挥特定的治疗作用[5]。近些年的研究发现车前草是一种有效的伤口愈合剂，同时也是一种抗溃疡、抗糖尿病、抗腹泻、抗炎、抗伤害、抗菌和抗病毒药物[6]。目前，国内外报道中，关于车前草中总黄酮提取相关研究的报道相对较少，相关人员对技术变更的了解较少，因此，优化车前草总黄酮提取工艺，为有效提取、纯化车前草黄酮类成分，合理利用车前草，提高其药用价值具有较大意义。

研究采用响应面法对车前草中黄酮类化合物的提取工艺进行优化，通过蓖麻油诱导小鼠腹泻模型和小鼠肠道蠕动模型探究车前草黄酮类化合物对腹泻的影响，为车前草总黄酮的工业化生产及用于治疗仔猪腹泻药物的开发提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级昆明小鼠共30 只，雌雄各半，体重18～22 g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 实验药物

车前草购自中国黑龙江省哈尔滨市中草药市场；芦丁对照品购自上海源叶公司；蓖麻油购自天津福晨化学试剂公司。

1.1.3 仪器设备

表1 仪器设备Table 1 The detail information of instruments

1.2 实验方法

1.2.1 车前草总黄酮标准曲线的测定

按照朱良会，张意笠等[7-8]利用NaNO2-Al（NO3）3比色法绘制车前草总黄酮标准曲线，具体操作如下：分别精确吸取每毫升含0.1 mg 芦丁的标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，将溶液分别加入已准备好的试管中；分别将浓度为30%的乙醇溶液加入到各个试管中，使溶液体积固定在5 mL；再向试管中加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液；轻摇溶液使其混合均匀，置于室温下静置6 min；向其中加入0.3 mL 的Al（NO3）3溶液，再次混合均匀后静置6 min；最后向其中加入4 mL 浓度为1 mol·L-1的NaOH 溶液及0.4 mL 的蒸馏水，再次混合均匀后，于室温下静置15 min。分别置于510 nm 的波长下并测定其吸光度，根据分光光度计输出结果绘制出吸光度的标准曲线。

1.2.2 车前草总黄酮提取

选取料液比、提取温度、提取时间、乙醇浓度作为变量，控制其他三个变量相同，只改变其中一个变量，分别对车前草中提取的总黄酮含量进行测算。测算方法是：首先收集提取出的溶液，将其置于3 000 rpm·min-1的离心机中离心5 min；取出上清液并过滤，将过滤后溶液用一定浓度的提取溶剂将其定容到25 mL；根据分光光度计输出结果绘制出标准曲线，以确定总黄酮的质量浓度。

1.2.3 车前草总黄酮提取率测定

取出5 mL 的黄酮提取液，按照1.3.1 中的方法对提取液中的总黄酮的质量浓度进行测定，根据总黄酮提取率（mg·g-1）=总黄酮质量浓度×提取液体积×稀释倍数/车前草质量公式对提取率进行计算。

1.2.4 单因素分析

分别取出料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 的溶液，在浓度为70%的乙醇溶液、温度为80 ℃的环境下2 h，测量其黄酮含量；取出料液比为1∶20 的溶液，将温度分别设定在70、75、80、85、90 ℃，同样在70%的乙醇溶液环境下2 h 进行提取，测定其黄酮含量；取出料液比为1∶20 的溶液，将温度设定在80 ℃，分别提取时间分别为1、1.5、2、2.5、3 h，测定黄酮的含量；取出料液比为1∶20 的溶液，将温度设定在80 ℃，在乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%的条件下提取时间2 h，测定其酮含量。

1.2.5 响应面法优化

研究选择硝酸铝显色法作为检测方法对溶液中的黄酮含量进行检测，并根据公式计算提取率。研究在Box-Behnken 分析的基础上，设定提取时间、乙醇体积分数、料液比、提取温度这四个变量，分别作为自变量，将总黄酮提取率的变化值作为因变量，通过Design-Expert 8.0.5 对其最优提取条件进行测算，结果见下表2 中。

表2 响应面试验设计因素与水平Table 2 Response surface test factors and levels

1.2.6 车前草总黄酮抗蓖麻油诱导的腹泻模型试验

按照南苹瑶[29]利用蓖麻油诱导小鼠腹泻制作小鼠腹泻模型，在进行实验前，将实验小鼠禁食18 h，根据随机性原则将30 只小鼠分为5 组，每组6 只，第一组灌服0.2 mL 的蒸馏水，作空白对照；第二组灌服0.2 mL 的蓖麻油（在其他组灌服药物1 h 之后灌服）；第三、四、五组分别按低剂量组（100 mg·kg-10.2 mL）、中剂量组（200 mg·kg-10.2 mL）、高剂量组（300 mg·kg-10.2 mL）灌服车前草总黄酮提取物0.2 mL，作为药物组，灌服1 h 后，各组均灌服0.2 mL 蓖麻油。观察并记录连续6 h 内小鼠的初次腹泻时间、总排便次数、计算排便抑制率。

1.2.7 车前草总黄酮抗蓖麻油诱导的肠蠕动模型试验

同样按照1.2.6 上述方法对实验小鼠进行禁食、随机分配、药物灌服，第一组灌服0.2 mL 的蒸馏水，作空白对照；第二组灌服0.2 mL 的蓖麻油（在其他组灌服药物1 h 之后灌服）；第三、四、五组分别按低剂量组（100 mg·kg-10.2 mL）、中剂量组（200 mg·kg-10.2 mL）、高剂量组（300 mg·kg-10.2 mL）灌服车前草总黄酮提取物0.2 mL，作为药物组；1 h 后，各组小鼠均灌服0.2 mL 标准碳粉溶液；30 min 后，将小鼠安乐死，从小鼠体内取出小肠，将小肠均匀展开形成直线，对小肠的总长度、碳粉溶液在小肠内的推进距离进行计算。

2 结果与分析

2.1 单因素分析结果

通过单因素分析法验证了不同条件下黄酮的提取效率变化情况，结果显示，不同因素对黄酮提取率的影响见下图1（A～D）中所示，从图中可以看出，在其他因素不变的条件下，料液比增加，黄酮取得率先增加，在料液比为1∶15 时最高，随着液料比改变，其黄酮提取率趋势无变化，详见图1-A。在其他因素不变的条件下，随着提取温度的升高，黄酮提取率呈现先增加后降低的趋势，当温度达到80 ℃时，总黄酮提取率最高，85 ℃有下降趋势，见图1-B。在其他因素不变的条件下，随着提取时间的增加，黄酮取得率在一定时间范围内持续上升，在2 h 时达到峰值，见图1-C。在其他因素不变的条件下，乙醇浓度的增加使黄酮的提取率显著上升，在浓度为70%时最高，见图1-D。

图1 单因素考察料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、乙醇浓度（D）对黄酮提取效果的影响Fig.1 Effects of solid-liquid ratio（A），extraction temperature（B），extraction time（C）and ethanol concentration（D）on PTF extraction investigated by single factor method

2.2 响应面法实验设计优化结果

实验目的是寻找最优条件下的黄酮提取率，通过单因素分析的实验数据用响应面法进行分析，为了更好地测定黄酮类化合物的含量，采用紫外分光光度法测定了黄酮类化合物的含量。以芦丁为参考物质，在510 nm 处测定不同已知浓度的芦丁的吸光度值。以芦丁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线的r2值为0.999 5，符合标准曲线的使用条件。将提取时间、乙醇体积分数、料液比、提取温度作为变化因素，对其中单一因素的影响情况进行响应面优化，然后通过Design-Expert 8.0.5 对其最优提取条件进行测算，利用ANOVA 进行响应面回归，结果如下表3 所示。模型的均方误差为0.015 6＜0.05，表明模型回归显著，实验方法可靠。结果如图2所示，通过RSM 得到了最佳的提取条件，当乙醇浓度为70.36%，提取温度为85.6 ℃，提取时间为1.29 h，液材比为1∶15.99 时，得到车前草总黄酮的提取率。得到了二次多元拟合回归模型方程：提取率=11.28+0.62 A+0.68 B+0.41 C+0.75 D-0.15 AB-0.56 AC-0.43 AD-0.33 BC+0.11 BD+0.2 CD-0.57 A2-0.8 B2-1.28 C2-0.87 D2，在最佳提取条件下，总黄酮类化合物的提取速率为12.41 mg·g-1，从该提取过程中提取的总黄酮类化合物用于后续实验。（A 为乙醇浓度，B为提取温度，C 是为提取时间，D 为料液比。）

图2 响应面结果Fig.2 Response surface result

表3 响应面法实验设计Table 3 Response surface methodology experimental design

2.3 车前草总黄酮抗蓖麻油诱导的腹泻模型试验结果

通过蓖麻油诱导小鼠腹泻制作小鼠腹泻模型验证该药物对小鼠腹泻次数的影响，结果如图3-A 所示，给药组的小鼠腹泻次数比腹泻对照组要极显著降低（P＜0.01）。通过蓖麻油诱导小鼠腹泻制作小鼠腹泻模型验证该药物对小鼠腹泻初次时间的影响，如图3-B 所示，给药组的首次腹泻开始时间要比腹泻对照组晚。这表明总黄酮能够有效抑制小鼠腹泻。

图3 小鼠腹泻次数（A）、小鼠初次腹泻时间（B）Fig.3 Diarrhea times of mice（A），time of first diarrhea of mice（B）

2.4 车前草总黄酮抗蓖麻油诱导的肠蠕动模型试验结果

通过蓖麻油诱导小鼠腹泻制作小鼠腹泻模型验证该药物对小鼠肠蠕动的影响，结果如图4 所示，与健康对照组比较，腹泻对照组碳墨法推进率显著后移（P＜0.05），显示碳墨已经推进至模型组小鼠小肠末端，表明实验采用蓖麻油诱导小鼠腹泻造模成功。车前草总黄酮给药组与腹泻对照组比较，腹泻模型组碳墨法推进率显著降低（P＜0.05）。

图4 碳粉推进比Fig.4 Carbon powder propulsion ratio

3 讨论

腹泻是一种在动物群体中常见且高发的疾病，腹泻可以使动物营养不良，导致维生素缺乏，引起动物贫血，降低动物抵抗力以及造成动物机体平衡紊乱，腹泻严重时可以导致动物死亡，给养殖业造成巨大的经济损失[9]。腹泻的最主要因素是细菌性感染，这类因素对腹泻的预防和治疗非常不利。迄今为止，各种实验药物和策略已用于治疗腹泻，例如使用新霉素、消胆胺/左氧氟沙星和头孢泊肟等抗生素[10]。虽然这些策略可以缓解腹泻，但由于引起腹泻的发病机制复杂，并不能完全阻断腹泻，寻找针对动物腹泻的替代治疗方法变得越来越迫切，因此特异性天然抗腹泻药物已成为研究者的热点之一。更重要的是，天然药物中许多活性成分的存在减少了药物耐药性的发生。这是由于天然药物中不同生物活性成分的独特特征，包括多个靶点和复杂的机制[11]。天然药物已成为筛选抗急性腹泻药物的最佳选择。目前，蓖麻油诱导小鼠腹泻模型已广泛应用于抗腹泻药物的临床筛选[12]，蓖麻油释放的蓖麻油酸刺激胃肠道黏膜，导致胃肠道炎症、胃肠道分泌增加，胃肠道运动增强[13-14]，此外，由于碳粉表面为多孔结构，大量药物会吸附在碳粉的表面，这使得碳粉具有了标记作用，如果药物能够减慢肠道的蠕动，通过给小鼠灌注碳粉并取出小鼠小肠，观察粪便在小肠中的位置，就可以据此推断出药物是否能够减慢肠道的蠕动。在研究中，腹泻组的碳粉推进率要明显减少（P＜0.05），这一结果与其他研究人员的研究结论基本一致[15-18]，说明黄酮具有减慢肠道蠕动的作用。

研究中所使用的响应面法在黄酮类化合物的提取方面具有广泛的应用，一方面，方法不仅能够弥补正交试验的不足，而且有助于研究者找出最优影响因素和最优组合的响应价值，降低检测的数量，全面了解各个因素的影响水平高低[19]；另一方面，从药用植物中提取有效成分对药物的开发和利用有很大的影响[20]，研究人员通过优化提取过程，实现了在有限条件下获得更多提取物的目标[21]。其中，响应面法（RSM）已广泛应用于不同的工艺优化领域。例如，利用RSM 优化橄榄饼油的超临界二氧化碳提取工艺，有效提高了食品化学的产量和生物活性分子的含量，同时分析了RSM 和人工神经网络（ANN）对膜润湿的影响[22]，RSM 操作方便，同时考虑多种因素对工艺的影响。从而计算最佳提取条件，这就是药用植物活性成分的提取。该研究中，优化了车前草黄酮的提取过程。基于黄酮类化合物容易溶于醇，广泛应用于黄酮类化合物的提取[23]，响应曲面法（RSM）被用来优化影响提取速率的四个关键因素，包括乙醇的体积分数、提取温度、提取时间和料液比。RSM 具有高精度、高效、模型构建准确的特点，广泛应用于各种专业工艺优化，特别是天然化合物的提取[24-25]。采用Box-behnken 设计（BBD）RSM 优化模拟车前草总黄酮的提取工艺，与RSM 的复合设计（CCD）相比，BBD通过更少的试验可以更有效地获得最佳条件[26]。因此，BBD 设计了29 组实验，研究了4 个因素对车前草黄酮提取率的影响，得到了6 个二次因素模型，结果表明四个因素存在显著相关性，当乙醇浓度为70.36%，提取温度为85.6 ℃，提取时间为1.29 h，料液比为1∶15.99，方法可以得到总黄酮的提取率。车前草黄酮的提取率为12.41 mg·g-1。

研究采用蓖麻油诱导腹泻模型评价了黄酮类化合物的抗腹泻作用。结果表明，车前草总黄酮可显著减少小鼠腹泻次数，且呈剂量依赖性。车前草总黄酮类化合物能显著抑制肠道蠕动，从而抑制肠道蠕动，减少腹泻的形成[27-28]。表明车前草总黄酮具有研究开发价值和潜力，为深入研究车前草黄酮化合物及提高车前草资源开发利用提供理论依据，同时也为开发车前草作为抗腹泻药物提供科学依据。