灌服酒炙车前子活性组分的胎衣不下奶牛血清代谢产物LC-MS/MS 法分析

鲁文赓，周继伟，田春雨，司琳清，袁思琦，谢何昕，申贵男

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.吉林省榆树市农业综合行政执法大队；3.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院）

奶牛胎衣不下（Retained placenta，RP）又称胎衣滞留，是指奶牛在产后12 h 以内未能将胎衣正常完全排出的一种奶牛繁殖障碍性疾病，根据报道，奶牛胎衣不下可引起子宫积脓和子宫内膜炎等繁殖障碍性疾病[1]，严重者可引起奶牛败血症，还可造成奶牛产犊间隔延长、产奶量减少以及子宫复旧延迟等[2-3]。此外，奶牛哺乳期因胎衣不下产奶量降低约753 kg·头-1，每年每头造成的产奶损失、治疗损失以及人工费用约$ 386[4]，给奶牛养殖业造成重大的影响。目前，大多数养殖业依然采用传统方法来治疗胎衣不下，例如肌注催产素、子宫灌注抗生素、手术剥离胎衣以及灌服中草药制剂等办法[5-7]，虽具有一定的疗效，但同时也会造成抗生素残留和/或激素残留等弊端，给养殖业和食品安全带来重大的隐患，因此研发高效、安全、便捷、廉价的治疗奶牛胎衣不下的中草药针剂必不可少。

《元亨疗马集·牛经》中最早记载了酒炙车前子治疗奶牛胎衣不下的处方，并且近些年许多研究者验证了其疗效，发现其治疗效果能够高达60%[8-9]，故为了明确该药的有效物质基础，在前期研究过程中，实验室建立酒炙车前子中有效物质的分离体系，确定了活性组分Ⅲ和Ⅵ是治疗奶牛胎衣不下的有效物质，并阐明了活性组分Ⅲ和Ⅵ的有效成分[10-11]，但治疗奶牛胎衣不下时酒炙车前子活性组分的体内有效成分尚不清楚。由于LC-MS/MS 技术表现出了灵敏度高，选择性强的特点，在临床检测时无论是应用到放射性免疫检测还是应用化学检测时，都是其他方法遥不可及的，尤其是在串联质谱技术的应用中，可以使化合物结构信息变得更加明显[12]，例如曹洁等[13]用LC-MS/MS 法检测人血液中的利多卡因及其代谢物。鉴于此，实验采用LC-MS/MS 技术对酒炙车前子治疗奶牛胎衣不下活性组分Ⅲ和Ⅵ的化学成分进行体内代谢分析及鉴定，进而阐明其治疗奶牛胎衣不下的有效物质基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验于黑龙江省北安市某牧场进行，每天饲喂全混合日粮（TMR），分别为早上5：00、下午1：00 以及晚上9：00，共3 个时间点饲喂，期间奶牛可以自由饮水、进食和运动。之后从中挑选没有分娩异常，以及重大的产前产后疾病，年龄在2～5 岁、胎次为1～3胎、体况评分（BCS）在2.5～3.5 之间、妊娠期为275～285 d 的胎衣不下的奶牛共15 头进行实验，分为活性组分Ⅲ组（5 头，每头0.297 g）、活性组分Ⅵ组（5头，每头0.118 g）和阴性对照组（5 头，每头生理盐水500 mL）。

1.2 主要试剂与器材

车前子，规格为500 g·袋-1，产自江西省吉安市，购买于仁人试剂经销部（哈尔滨），2-氯苯丙氨酸，甲酸，无水乙醇、石油醚、二氯甲烷和乙酸乙酯购自泉瑞试剂（辽宁）有限公司，甲醇、乙腈、超纯水购自默克集团（德国）有限公司。RE52-99 型旋转蒸发仪购自荣亚生化仪器厂（上海），LyoQuest-55 型冷冻干燥机购自泰事达（西班牙）科技公司，Acquity 超高效液相色谱仪沃世特科技（上海）有限公司，Q Exactive 质谱仪Thermo Fisher Scientific（美国）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品采集

前期实验室进行了药效筛选实验，确定了酒炙车前子治疗奶牛胎衣不下的是活性组分Ⅲ、Ⅵ。并参照实验室前期分离体系[10]，在二氯甲烷∶甲醇（30∶1）洗脱剂中获得其活性组分Ⅲ、Ⅵ的浸膏。然后将获得的浸膏与生理盐水按照比例1∶500 口服直接灌胃，随后在灌服药物后0，6，12 h 经尾静脉采集血液，并以3 600×g 离心，收集血清。

1.3.2 UPLC 梯度洗脱

采用ACQUITY UPLC HSS T3 型号的色谱柱，其直径×高为2.1×100 mm，粒径为1.8 μm，一次进样10 μL，自动进样器的温度调至4 ℃，进行梯度洗脱时以水+0.05%甲酸（A），乙腈（B）为流动相条件进行洗脱，具体的梯度洗脱程序为A：0～12 min 时95%～5%；12～13.6 min 时5%～95%；13.6～16 min 一直为95%。B：0～12 min 时5%～95%；12～13.6 min 时95%～5%；6～16 min 一直为5%。每次进样的量为10 μL，柱温调至为40 ℃，流速调至0.3 mL·min-1。

1.3.3 质谱检测

采用ESI 电喷雾离子源，同时在正、负离子模式下检测，以70～1 050 为质量的扫描范围，分辨率为17 500；以45 arb 为鞘气流速；以1 arb 为尾气的流速；以300 ℃为加热器温度；以350 ℃为毛细管温度；正模式下电喷雾电压为3.0 KV，S-Lens RF Level，30%，负模式下电喷雾电压为3.2 KV，S-Lens RF Level，60%。以15 arb 为辅助气流速。

1.4 数据处理

利用Compound Discoverer 软件（Thermo 公司）提取并且预处理LC/MS 检测到的数据，然后利用Xcalibur 分析软件进行分析处理并结合网络数据库Metlin、HMDB、KEGG 及文献数据进行碎片及精确相对分子质量匹配，筛选相对分子质量实测值与理论值偏差绝对值小于5×10-6的化合物，即为酒炙车前子治疗奶牛胎衣不下活性组分的体内可能有效成分。

2 结果与分析

2.1 活性组分Ⅲ的体内代谢产物鉴定

采用LC-MS/M 技术定性分析酒炙车前子治疗奶牛胎衣不下活性组分Ⅲ，ESI（+）和ESI（-）质谱离子流图（TIC）如图1 所示，其为活性组分Ⅲ体内代谢产物图。通过LC-MS/MS 技术检测得到活性组分Ⅲ的各种成份的相对分子质量以及保留时间等各种质谱信息，并利用Metlin、HMDB、KEGG，Pubchem 等数据库数据以及相关文献对离子流图进行比对，以质量偏差值小于绝对值5×10-6为原则，进行碎片离子匹配，其化学成分最终根据特征碎片分析确定。实验共在正离子模式下共分析出了11 个化合物，主要有有机杂环类3 个，脂类2 个，萜类，胺类，吡嗪类，吡喃酮，黄酮，其他类化合物各1 个（表1）。负模式下共分析出了13 个化合物，主要包括有机杂环类5 个，脂类和其他类化合物各2 个，核苷类，羧酸类，酚醌类，糖醇类各1 个（表2）。

表1 正离子模式下活性组分Ⅲ的代谢产物Table 1 Metabolites of active component Ⅲin positive ion mode

表2 负离子模式下活性组分Ⅲ的代谢产物Table 2 Metabolites of active component Ⅲin anion mode

图1 活性组分Ⅲ体内代谢产物的正模式（A）负模式（B）TIC 图Fig.1 Positive pattern（A）negative pattern（B）TIC diagram of metabolites of active component Ⅲin vivo

2.2 活性组分Ⅲ根据质谱裂解特征分析

正离子模式下以曲酸为例，曲酸的相对分子质量实测值是142.026 0，在保留时间（t保留）为0.321 min时，显示了m/z 143［M+H］+准分子离子峰，由于化学元素的组成各不相同，故分析该化合物的分子式应该为C6H6O4，依次脱去OH，C2H2O 后形成特征碎片m/z 125［M+H-OH］+，m/z 83［M+H-OH-C2H2O］+，推断裂解途径见图2，根据曲酸碎片离子峰信息并查阅相关文献[14]，与HMDB 等数据库比对后进一步推测该化合物可能为曲酸。吡嗪酸相对分子质量实测值为124.026 6，保留时间（t保留）为0.321 min 时，准分子离子峰为m/z 125［M+H］+，根据化学元素组成的不同，该化合物分子式应该为C5H5N3O，脱去CNO 后形成特征碎片m/z 81［M+H-CNO］+，推断裂解途径见图3，根据吡嗪酸碎片离子峰信息并查阅相关文献[15]，以及与HMDB 等数据库比对后，推测该化合物可能为吡嗪酸。

图2 正离子模式下曲酸的裂解途径Fig.2 Decomposition pathway of kojic acid in positive ion mode

图3 正离子模式下吡嗪酸的裂解途径Fig.3 Cleavage pathway of pyrazinic acid in positive ion mode

负离子模式下以白花丹素为例，白花丹素相对分子质量实测值为188.048 3，色谱保留时间（t保留）为0.826 min，以m/z 187［M-H］-为准分子离子峰，由于化学元素的组成各不相同，故分析该化合物的分子式应该为C11H8O3，脱去CH5，C2O2后，形成特征碎片m/z 171［M-H-CH5］-以及m/z 115［M-H-CH5-C2O2］-，裂解途径见图4，根据白花丹素碎片离子峰信息并查阅相关文献[16]，与HMDB 等数据库比对后进一步推测该化合物可能为白花丹素。此外，测得2，4-二氯苯酚相对分子质量为161.963 8，保留时间（t保留）为8.271 min 时，显示了m/z 160［M-H］-准分子离子峰，由于化学元素的组成各不相同，故分析该化合物的分子式应该为C11H8O3，H2Cl 被脱掉后，形成了特征碎片m/z 125［M-H-H2Cl］-，裂解途径见图5，根据图2，4-二氯苯酚碎片离子峰信息以及查阅相关文献[17]，以及与HMDB 等数据库比对后，推测该化合物可能为2，4-二氯苯酚。

图4 负离子模式下白花丹素裂解途径Fig.4 Degradation pathway of chrysanthine in anion mode

图5 负离子模式下2，4 二氯苯酚裂解途径Fig.5 Pyrolysis pathway of 2，4 dichlorophenol in anion mode

2.3 活性组分Ⅵ体内代谢产物的鉴定

采用LC-MS/M 技术定性分析酒炙车前子治疗奶牛胎衣不下活性组分Ⅵ，ESI（+）和ESI（-）的质谱离子流图（TIC）如图6 所示，其为活性组分Ⅵ体内代谢产物图。通过LC-MS/MS 技术检测得到活性组分Ⅵ的各种成份的相对分子质量以及保留时间等各种质谱信息，并利用Metlin、HMDB、KEGG，Pubchem 等数据库数据以及相关文献对离子流图进行比对，以质量偏差值小于绝对值5×10-6为原则，进行碎片离子匹配，最终根据特征碎片确定其化学成分。正模式下共分析出了14 个化合物，主要有有机杂环类4个，其他类化合物2 个，胺类，烷类，萜类，脂类，吲哚类，酰胺类，酚类，磷酸各1 个（表3）。负模式下共分析出了12 个化合物主要包括核苷类和其他类化合物各3 个，有机杂环类2 个，脂类，萜类，黄酮，羧酸类各1 个（表4）。

表3 正离子模式下活性组分Ⅵ的代谢产物Table 3 Metabolites of active component Ⅵin positive ion mode

表4 负离子模式下活性组分Ⅵ的代谢产物Table 4 Metabolites of active component Ⅵin anion mode

图6 活性组分Ⅵ体内代谢产物正模式（A）负模式（B）TIC 图Fig.6 Positive（A）negative（B）TIC pattern of metabolites in active component Ⅵ

2.4 活性组分Ⅵ根据质谱裂解特征分析

正离子模式下以丹皮酚为例，相对分子质量实测值为166.062 6，在保留时间（t保留）为3.476 min时，出现m/z 167［M+H］+准分子离子峰，由于化学元素的组成各不相同，故分析该化合物的分子式应该为C9H10O3，脱去OH 后形成了特征碎片m/z 149［M+H-OH］+，裂解途径见图7，根据丹皮酚碎片离子峰信息并查阅相关文献[18]，与HMDB 等数据库比对后进一步推测该化合物可能为丹皮酚。测得五氧二十碳四烯酸（5-KETE）相对分子质量为318.217 8，在保留时间（t保留）为10.322 min 时，出现m/z 319［M+H］+准分子离子峰，由于化学元素的组成各不相同，故分析该化合物的分子式应该为C20H30O3，之后C4H7O2，C5H10，C5H6被去除，形成了特征碎片m/z 231［M+HC4H7O2］+，m/z 161［M+H-C4H7O2-C5H10］+，m/z 95［M+HC4H7O2-C5H10-C5H6］+，裂解途径见图8，根据5-KETE碎片离子峰信息并查阅相关文献[19]，与HMDB 等数据库比对后进一步推测该化合物可能为5-KETE。

图7 正离子模式下丹皮酚裂解途径Fig.7 Paeonol pyrolysis pathway in positive ion mode

图8 正离子模式下5-KETE 裂解途径Fig.8 5-KETE cleavage pathway in positive ion mode

负离子模式下以甘草苷为例，甘草苷相对分子质量实测值为418.126 3，保留时间（t保留）为5.029 min时，出现m/z 417［M-H］-准分子离子峰，由于化学元素的组成各不相同，故分析该化合物的分子式为C21H22O9，脱去C4H11O5，C10H7O 后形成m/z 279［M-HC4H11O5］-，m/z 135［M-H-C4H11O5-C10H7O］-等碎片离子峰，裂解途径见图9，根据甘草苷碎片离子峰信息并查阅相关文献[20]，以及与HMDB 等数据库比对后，推测该化合物可能为甘草苷。

图9 负模式下甘草苷裂解途径Fig.9 Lytic pathway of liquiritin in negative mode

3 讨论

在中国，车前子很早以前就有用来治疗奶牛胎衣不下的历史，因此，在以往的研究中，测定了治疗奶牛胎衣不下的有效成分是酒炙车前子的活性组分Ⅲ和Ⅵ，并已测定活性组分的有效成分[21-23]，但尚不明确治疗奶牛胎衣不下中酒炙车前子活性组分的体内有效成分是哪个。因此，研究利用了LC-MS/MS 技术分析鉴定了用于治疗奶牛胎衣不下的酒炙车前子活性组分Ⅲ和Ⅵ的体内有效成分。分析灌服活性组分Ⅲ的奶牛血清，共有24 种成分在正、负离子模式下鉴定出来。根据质谱裂解特征在正离子模式下分析确定含有曲酸，有研究表明，曲酸能降低丙二醛（MDA）含量，提高苯丙氨酸解氨酶（PAL）和过氧化氢酶（CAT）活性，从而提高抗氧化能力，在SAHDEV[24]的研究中发现吡嗪酸可以清除活性氧（ROS），使体内的谷胱甘肽（GSH），CAT 和超氧化物歧化酶（SOD）恢复到基本水平，进一步达到奶牛胎衣脱落的目的。在负模式中根据质谱裂解特征确定含有白花丹素，白花丹素属于典型的酚醌类化合物，其醌环是酚羟基的主要抗氧化的基团，可以降低组织内ROS 水平，使SOD 和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）的活力得到明显提升，有效的降低了氧化应激损伤的程度[25]。其次2，4-二氯苯酚可以增加雄激素含量，在研究结果中，发现脱氢表雄酮含量明显上升，脱氢表雄酮可以使雌二醇含量增加[26-27]，雌二醇的升高可令子宫肌对催产素的更加敏感，并且在雌二醇与催产素共同作用下，可使子宫肌开放，子宫收缩力加强，进而使胎衣脱落。

与此同时，分析灌服活性组分Ⅵ的奶牛血清，共有26 种成分在正、负离子模式下鉴定出来。根据质谱裂解特征在正离子模式下分析确定含有丹皮酚，而丹皮酚是小分子酚类化合物，可以使核因子E2 相关因子2（Nrf2）/血红素氧合酶1（HO-1）显著提升，并且使SOD 的活力得到增强，降低MDA 的含量[28]，达到治疗奶牛胎衣不下的目的。5-KETE 是花生四烯酸经过5-脂氧合酶选择性合成的产物，当机体受到氧化刺激或细胞死亡时，5-KETE 的大量合成，其大量合成在嗜酸性粒细胞上表达的很明显，并且它在中性粒细胞细胞上也有表达，进而降低炎症反应[29]，从而治疗奶牛胎衣不下。此外，甘草苷在负模式下根据质谱裂解特征被分析确定，其具有镇痛，抗氧化，抗炎等作用，能够提高GSH 和CAT 的活性，使MDA的含量减少，降低了白介素8（IL-1β）、白介素6（IL-6）的表达[30]，进一步达到使奶牛胎衣脱落的目的。

综上所述，实验采用LC-MS/MS 技术，分析了酒炙车前子治疗奶牛胎衣不下的活性组分Ⅲ和Ⅵ的体内代谢产物，对其代谢产物的精确分子量及二级裂解进行分析，并与相关数据库和参考文献进行比对，共鉴定出24 种化合物与活性组分Ⅲ有关，活性组分Ⅵ有26 种化合物与其相关，其中，有机杂环类，脂类，萜类，胺类，黄酮，羧酸类为活性组分Ⅲ和Ⅵ共有成分，此外，活性组分Ⅲ还含有吡嗪类，核苷类，酚醌类，糖醇类，活性组分Ⅵ还含有烷类，吲哚类，酰胺类，酚类。实验阐明了酒炙车前子治疗奶牛胎衣不下活性组分Ⅲ和Ⅵ的体内可能有效成分，从而为今后研发高效、安全和廉价的防治奶牛胎衣不下的中药针剂提供了新方向。