外泌体在肺癌发生发展和诊疗中的研究进展△

厉杨，马爱玲，王丽娜，张黎明，张子腾

1济宁医学院临床医学院，山东 济宁 272067

2青海红十字医院胸外科，西宁 810000

济宁医学院附属医院3医学研究中心，4胸外科，山东 济宁 272029

肺癌是最常见的肿瘤之一，其发病率（11.4%）仅次于乳腺癌（11.7%）；同时，肺癌也是全球范围内病死率（18.0%）最高的肿瘤[1-2]。肺癌按照病理分型可以分为小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），后者又分为肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）、肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和大细胞肺癌（large cell lung carcinoma，LCC）[3]。肺癌的发病机制目前尚不明确，吸烟是引起肺癌的主要因素。随着研究的深入发现，木材燃烧产生的气体、汽车尾气、大气污染对肺癌的发生也有一定的影响[4]。目前，手术治疗联合化疗、分子靶向治疗以及免疫治疗在肺癌的治疗中取得了一定成效。但由于肺癌进展迅速，多数患者诊断时已属晚期，预后不良。因此，积极探究肺癌发生发展的相关机制尤为重要。

外泌体（exosome）是细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）的一种，是质膜向内出芽形成的细胞内核内体，后者逐步成熟，不断在细胞内聚集，形成多泡体（multivesicular body，MVB），随后MVB与溶酶体融合并降解其内容物，或者与质膜融合并释放其中的膜结合物，后者就是外泌体[5-6]。几乎所有的人体细胞都可以分泌外泌体，如红细胞、淋巴细胞、神经细胞、上皮细胞和肿瘤细胞等[7-9]。外泌体不止分布在血液中，也分布在脑脊液、淋巴液、滑膜液、羊水、腹腔积液等多种体液中[10]。外泌体的直径一般为40～150 nm，包含了多种生物活性成分，如细胞代谢物、DNA 片段、环状RNA（circular RNA，circRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、信使RNA（messenger RNA，mRNA）、多聚糖、蛋白质和脂质等[11]。外泌体有与细胞膜相似的磷脂双分子层结构，可使其顺利地与靶细胞结合，释放相关生物活性成分，发挥相应的生物学功能[12]。近年来的研究证实，外泌体可通过影响肺癌细胞的增殖、侵袭、上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、血管生成以及耐药等过程参与肺癌的发生发展[13]。此外，外泌体可作为生物标志物、药物运载体以及肿瘤疫苗在肺癌的诊疗中发挥重要作用[14-15]。本文对外泌体参与肺癌发生发展的机制及其在肺癌诊疗中的潜在应用进行综述，以期为肺癌的临床治疗提供新的思路和方向。

1 外泌体与肺癌进展

近年来，大量研究证实外泌体与肺癌的进展有关。外泌体可以通过介导环状RNA 液泡膜蛋白1（circular RNA vacuole membrane protein 1，circVMP1）作用于miRNA-524-5p，进而上调甲基转移酶3（methyltransferase 3，METTL3）和SRY 盒转录因子2（SRY-box transcription factor 2，SOX2）的表达，最终促进NSCLC 的进展[16]。有报道称，肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast，CAF）来源的外泌体在肺癌的进展中起促进作用。CAF 分泌的外泌体可以通过其携带的lncRNA Opa 相互作用蛋白5 反义RNA1（Opa interacting protein 5 antisense RNA 1，OIP5-AS1）调节细胞中的miRNA-142-5p，进而抑制外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）对肺癌细胞的杀伤、吞噬作用，从而促进肺癌的进展[17]。相关文献报道，铁死亡是一种由磷脂过氧化驱动的调节细胞死亡的方式，此过程依赖铁和活性氧（reactive oxygen species，ROS），细胞学上表现为线粒体嵴减少或消失、线粒体膜缩小和线粒体外膜破裂[18-19]。研究表明，铁死亡与肺癌的进展密切相关。肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中CAF 和间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）来源的外泌体可以抑制miRNA 或蛋白质介导的铁死亡，进而促进肺癌的进展[20]。

研究发现，肺癌细胞自身分泌的外泌体在肺癌的进展中也具有重要作用。Morrissey 等[21]发现，肺癌细胞来源的外泌体能够通过促进炎性细胞因子分泌、中性粒细胞浸润和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）募集以及肿瘤新生血管生成促进肿瘤进展。有研究报道，CD8+T 细胞的肿瘤免疫功能可被NSCLC 分泌的外泌体中的环状泛素特异性肽酶7（circular ubiquitin specific peptidase 7，circUSP7）抑制，后者能够进入CD8+T 细胞中，通过靶向miRNA-934 上调含Src 同源2 结构域蛋白酪氨酸磷酸酶2（Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2，SHP2）的表达，进而促进CD8+T 细胞凋亡，抑制CD8+T 细胞对肿瘤的免疫功能，从而促进肺癌的进展[22]。上述研究表明外泌体可通过递送相关生物活性成分促进肺癌的进展。

2 外泌体与EMT

EMT是上皮细胞获得间充质细胞特征的过程[23]，在肿瘤中通过增强肿瘤细胞的移动性、侵袭性和对细胞凋亡程序的抵抗作用，促使肿瘤的侵袭和转移过程。此外，EMT 来源的肿瘤细胞获得相应的干细胞特性，并表现出明显的耐药性[24]。

MSC 是TME 的组成部分，有助于肿瘤进展。肿瘤内的缺氧环境可以影响肿瘤的实质细胞和基质细胞[25]。研究表明，缺氧环境可能重塑MSC，分泌富含miRNA-21-5p 的外泌体，将其递送到肿瘤细胞和巨噬细胞，介导肿瘤细胞的存活和免疫抑制。缺氧环境中MSC 分泌的外泌体作用于TME，上调N-钙黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（vimentin）的表达，从而促进NSCLC 细胞的EMT[26]。研究发现，缺氧条件下骨髓来源的间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC）分泌的外泌体可被邻近的肺癌细胞吸收并促进肿瘤细胞侵袭和EMT。同样，缺氧条件下BMSC 来源的外泌体介导miRNA-193a-3p、miRNA-210-3p 和miRNA-5100 进行肺癌细胞间转移，作用于信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3），进而上调间充质相关分子的表达，促进肺癌细胞的侵袭、迁移和EMT[25]。

研究表明，TME 中肿瘤相关巨噬细胞（tumorassociated macrophage，TAM）在肿瘤的发生发展中起着重要作用。TAM 分为M1 和M2 两个亚型，M1型TAM 可以抑制NSCLC 的新生血管生成，具有抑制肿瘤的作用；而M2 型TAM 可激活NSCLC 细胞的EMT，促进肿瘤细胞的转移[27-28]。研究证明，M2型TAM 分泌的外泌体富含miRNA-155 和miRNA-196a-5p，可将其递送至肿瘤细胞，进而下调Ras 相关结构域家族成员4（Ras association domain family member 4，RASSF4）的表达，促进NSCLC 细胞的EMT 和迁移[29]。以上研究表明，在肺癌的TME 中，多种细胞来源的外泌体可介导相关的细胞成分参与肿瘤细胞EMT，促进肺癌的发生和转移。

3 外泌体与肺癌化疗耐药性

相关文献报道，外泌体可以影响化疗药物对肺癌的疗效，使肺癌对顺铂（cisplatin，DDP）、奥西替尼（osimertinib）、多西他赛（docetaxel，DTX）等化疗药物产生耐药性。近年来，DDP 被证实可以通过促进铁死亡和细胞凋亡影响NSCLC 的进展。相关研究证明，miRNA-4443 在DDP 耐药的NSCLC 分泌的外泌体中高表达，通过外泌体的细胞间通信功能，将miRNA-4443 递送至对DDP 敏感的肿瘤细胞，作用于METTL3/铁死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1，FSP1）介导的铁死亡途径，进而增强NSCLC 细胞对DDP 的耐药性[30]。有研究显示，DDP 耐药的NSCLC 细胞分泌外泌体将circVMP1 传递给DDP 敏感的肿瘤细胞，通过miRNA-524-5p/METTL3/SOX2 轴促进NSCLC 细胞增殖、侵袭、迁移及对DDP 的耐药，并抑制细胞凋亡[13]。还有研究报道，低氧环境可诱导DDP 耐药的NSCLC 细胞分泌外泌体，通过外泌体中的M1/2 型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M1/2，PKM2）促进肿瘤细胞糖酵解并产生还原性的代谢产物，后者可能与DDP 诱导的ROS 发生化学反应，抑制DDP 对肿瘤细胞的作用。此外，低氧可以诱导外泌体PKM2 重组CAF，创造酸性TME，进而增强肺癌细胞的耐药性[31]。

研究发现，外泌体可以影响奥西替尼在肺癌中的化疗作用。外泌体通过递送野生型表皮生长因子受体（wild type epidermal growth factor receptor，wtEGFR）至表皮生长因子受体突变（epidermal growth factor receptor- mutated，mutEGFR）的NSCLC 细胞，促进其对奥西替尼耐药。作用机制显示，外泌体富含wtEGFR 蛋白，通过细胞间转移作用于mutEGFR 的肿瘤细胞，激活磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3- hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）和促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路进而促进奥西替尼耐药[32]。

研究表明，DTX 耐药的LUAD 细胞可以分泌含有小核仁RNA 宿主基因7（small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7）的外泌体，将其传递到敏感的LUAD 细胞中，招募人类抗原R（human antigen R，HuR）稳定自噬相关基因5（autophagy related gene 5，ATG5）和自噬相关基因12（autophagy related gene 12，ATG12）进而促进自噬。此外，外泌体SNHG7通过招募支架蛋白4A（cullin 4A，CUL4A）诱导磷酸酶张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）的泛素化，激活PI3K/AKT 信号通路，促进巨噬细胞M2 极化。总之，外泌体SNHG7 通过促进自噬和巨噬细胞M2 极化，增强LUAD 对DTX的耐药性[33]。以上研究表明，外泌体可以通过递送相关的核酸和蛋白质促进肺癌细胞对化疗药物的耐药，促进肺癌进展。

4 外泌体在肺癌诊疗中的潜在应用

随着研究的不断进展，外泌体在肺癌中的作用越来越多地被报道，它不仅在肿瘤的发生发展中起作用，在肺癌的诊疗中也有相当重要的作用。外泌体有望成为肺癌的潜在生物标志物，还可通过其细胞间通信功能以及物质靶向递送能力来制备药物运载体及肿瘤疫苗，进一步治疗肺癌。

外泌体广泛分布于体液中，可从血液、尿液和唾液等体液中检测出，这为外泌体作为肺癌的潜在生物标志物提供可能。外泌体的检测方法有多种，如纳米粒子跟踪分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）、动态光散射（dynamic light scattering，DLS）、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）等常规检测技术以及表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）检测、比色检测、荧光成像、磁检测和电化学检测等基于微流控技术的检测方法[34]。检测血液中的外泌体是常规的检测手段。血液检测相比组织活检等具有创伤小、易获取和经济效益高等优点。外泌体具有磷脂双分子层，可在血液中稳定存在，保护RNA、蛋白质等内容物免受各类酶的降解。外泌体相比循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）和循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）等肿瘤生物标志物具有在血液中稳定存在和由活细胞分泌的优势，在血液检测中有较高的检出率，有更高的灵敏度和准确度[35]。受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线是反映灵敏度和特异度之间关系的曲线，ROC 曲线的曲线下面积（area under the curve，AUC）可反映实验预测的准确度，两者均是反映诊断实验真实性的重要指标。多项研究表明，在肺癌患者的血液中可检测到外泌体中lncRNA、circRNA 等出现相应的变化，lncRNA 远端无同源盒6 反义RNA1（distal-less homeobox 6 antisense RNA 1，DLX6-AS1）和circRNA-002178 的表达增加；lncRNA 生长停滞特异性转录本5（growth arrest-specific transcript 5，GAS5）的表达降低。lncRNA DLX6- AS1、lncRNA GAS5 和circRNA-002178 诊断肺癌的AUC 分别为0.806、0.857 和0.996；灵敏度分别为77.5%、85.9%和99.6%；特异度分别为85.9%、70.0%和100%。综合以上数据表明，外泌体lncRNA DLX6-AS1、lncRNA GAS5 和circRNA-002178 对肺癌的诊断具有重要意义，有望成为诊断肺癌的潜在生物标志物[36-38]。

近年来，外泌体在药物运载体和肿瘤疫苗的制备中取得了一定的突破。DTX 在肿瘤的治疗中发挥重要作用，但是因水溶性低和对肿瘤的选择性差在临床治疗肿瘤中受到了一定的限制。Wang 等[39]研究发现，通过外泌体递送DTX 对肺癌的治疗效果明显优于直接应用DTX，前者利用外泌体靶向递送和易与细胞膜结合的特点将药物更高效地递送至肿瘤细胞，扰乱细胞周期，引起细胞代谢紊乱，促进细胞凋亡，实现抑制肿瘤生长的药理作用。研究表明，外源性小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）可以使用靶向外泌体作为运载体，并递送到相关的靶细胞中发挥作用。外泌体可以作为siRNA 的高效运载体，使用外泌体运输、递送siRNA 可能是一种有效的治疗肺癌的方法[40]。有研究显示，TME 中含量最多的基质细胞是CAF，其在肿瘤发生发展、免疫抑制和耐药性等方面具有重要作用。可以制备一种外泌体样的肿瘤疫苗，同时靶向作用于肿瘤的实质细胞和基质细胞，即成纤维细胞活化蛋白基因工程肿瘤细胞源性外泌体样囊泡疫苗（fibroblast activation protein gene-engineered tumor cell-derived exosome-like vesicle vaccine，eNVs-FAP）。在肺癌荷瘤鼠中进行的探究发现，eNVs-FAP 可促进树突状细胞（dendritic cell，DC）成熟，增加效应T 细胞向肿瘤细胞和FAP 过表达的CAF 浸润，降低TME 中免疫抑制细胞的比例，进而抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[41]。以上研究表明，外泌体可以通过递送细胞成分和细胞间通信功能抑制肺癌的进展，从而达到治疗肺癌的目的。外泌体还可以作为药物运载体和肿瘤疫苗为肺癌的治疗提供新的方向。

5 小结与展望

目前，外泌体已不仅作为细胞代谢废物的“垃圾袋”而存在，还被证实含有核酸、蛋白质、脂质等生物活性成分，通过递送蛋白质等相关物质实现细胞间通信的生物学功能[42-43]。CAF、肺癌细胞等分泌的外泌体可影响TME，促进肿瘤细胞的增殖、EMT、侵袭和转移，并且促进肺癌对化疗药物耐药。但是，目前的外泌体制备和提纯方法还不成熟，存在较多问题，为研究带来了不便；关于外泌体在肺癌等疾病中作用机制的研究相对表浅，还需进一步探究。基于目前国内外的研究现状，在未来一段时间，需继续探究外泌体在肺癌中的生物学功能，进一步阐述其在肺癌发生发展中的作用，挖掘外泌体作为治疗靶点在肺癌诊疗中的作用，及其作为药物运载体、肿瘤疫苗和生物标志物在临床中应用的可能性，为肺癌的精准治疗和个体化治疗提供新的策略和方向。