基于生物信息学方法分析FAM20A在甲状腺癌中的诊断价值

吴南楠 尹瑞梨 孙荣欣 赵冬

甲状腺癌是内分泌系统中最常见的肿瘤之一,且发病率正迅速增加[1]。来自美国的一项研究显示晚期甲状腺癌的诊断有所增加,与总死亡率的缓慢增长相一致[2],故甲状腺癌的早期诊治对预后影响至关重要。积极探索甲状腺癌新的生物标志物是推动早期诊断和开发新的治疗策略的方法之一。目前关于甲状腺癌的具体发病机制尚未完全清楚,序列相似性20家族成员A(Family with sequence similarity 20 member A,FAM20A),作为一种分泌蛋白,已经被报道参与肝癌、甲状旁腺癌的发生发展[3-5],但其在甲状腺癌中的表达及与甲状腺癌的发生发展目前仍不明确。本研究利用TCGA和GEO数据库,联合临床样本,探索FAM20A在甲状腺癌中的表达及临床诊断意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象

利用TCGA 数据库(http://tcgadata.nci.nih.gov/),获取甲状腺癌相关数据,包括甲状腺癌组织样本512例,正常甲状腺组织样本59例,整理TCGA-THCA(甲状腺癌)项目STAR流程的RNAseq数据并提取TPM格式的数据以及临床数据。通过甲状腺癌组织样本(n=59)配对正常组织样本(n=59)分析FAM20A mRNA表达。另外,对512例甲状腺癌组织样本通过R 3.6.3软件整理基因表达数据,以FAM20A mRNA表达量中位值为界,分为高表达组和低表达组。数据过滤策略:去除无临床信息;数据处理方法:log2(value+1)。提取对应编号配对的癌旁和癌样本进行配对t检验。搜索GEO数据库,GSE205733检测平台为Illumina HiSeq 4000,包括正常甲状腺组织4例,甲状腺癌4例。应用R(3.6.3版本)软件包处理下载的文件,对数据进行校准、标准化和log2变换。收集2022年3月—2023年2月期间于首都医科大学附属北京潞河医院甲状腺外科行甲状腺结节手术治疗且知情同意该项目的29例患者病理组织样本,其中包括17例甲状腺癌(实验组),12例良性甲状腺结节(对照组)。本研究得到了首都医科大学附属北京潞河医院伦理委员会的批准,批号:2023-LHKY-045-02。

1.2 GSEA富集分析

GSEA用来评估一个预先定义的基因集的基因在与表型相关度排序的基因表中的分布趋势,从而判断其对表型的贡献。根据GSE205733数据集筛选出的正常甲状腺组和甲状腺癌组,根据基因风险进行评分,并与KEGG的基因集进行比对,对影响甲状腺癌的可能的作用机制进行探索。

1.3 免疫组织化学染色

应用免疫组化试剂盒(KIT-9710,迈新试剂),首先将石蜡切片置于60℃烤箱中烤片3 h,二甲苯脱蜡入水后,加入柠檬酸抗原修复液中进行热修复,使用内源性过氧化物酶阻断剂室温静置孵育10 min,PBS洗3次,每次3 min;滴加非特异性染色阻剂或阻断剂封闭液室温孵育20 min,FAM20A多克隆抗体(25258-1-AP,Affinity)按照1∶200稀释,直接滴加到组织上,4℃冰箱孵育过夜;次日,PBS洗3次,每次3 min,滴加生物素标记的二抗,室温孵育10 min;PBS洗3次,每次3 min;滴加链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶,PBS洗3次,每次3 min。室温下用显色剂DAB(PR30010,Proteintech)显色2 min后用自来水冲洗1 min;苏木素复染,梯度乙醇脱水入二甲苯,封片。使用奥林巴斯显微镜拍摄图像。采用Image J软件评估染色区域的面积百分比。

1.4 统计学分析

采用R 3.6.3软件、Image J软件和GraphPad Prism 9.5软件绘图,计数资料以频数(百分数)表示,组间比较采用χ2检验;两独立样本计量资料,符合正态分布采用独立样本t检验,不符合正态分布采用Wilcoxon秩和检验。甲状腺癌组和正常甲状腺组的比较采用配对t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FAM20A在甲状腺癌和正常甲状腺组织中的表达

TCGA数据库获得FAM20A在512例甲状腺癌组织和59例正常甲状腺组织中的表达数据,结果显示,与正常甲状腺组织相比,FAM20A表达在甲状腺癌中显著升高(P<0.001)(图1A);配对分析结果显示FAM20A在甲状腺癌中显著升高(P<0.001)(图1B)。

图1 甲状腺癌组织和正常组织中的FAM20A的表达水平及配对分析Figure 1 The expression of FAM20A in TC and normal tissuesNote:***P<0.001,when compared with the normal group.

利用GSE205733数据集,根据表达谱芯片信息提供的FAM20A mRNA表达进行分析,结果显示甲状腺癌组织中FAM20A表达明显高于正常甲状腺组织(P<0.001)(图2)。

图2 FAM20A在正常甲状腺组织和甲状腺癌组织中的表达差异Figure 2 The expression differences of FAM20A in TC and normal tissues Note:**P<0.01,when compared with the normal group.

2.2 FAM20A的差异表达与患者临床特征之间的关系

根据FAM20A表达量中位值,将甲状腺癌患者分为高表达组和低表达组,比较两组患者的临床特征。结果显示,两组病理T分期、N分期和病理类型差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)。这些结果提示,FAM20A与临床病例T分期、N分期和病理类型相关。

表1 甲状腺癌患者FAM20A高表达组和低表达组临床特征比较[n(%)]

2.3 FAM20A对甲状腺癌的诊断价值

利用TCGA数据集,ROC曲线分析结果显示,FAM20A表达对甲状腺癌具有较高的诊断价值(AUC=0.828,P<0.05)(图3)。

图3 FAM20A在甲状腺癌的ROC曲线分析Figure 3 The ROC curve of FAM20A in TC

2.4 GSE205733富集分析及FAM20A的相互作用蛋白

根据GSE205733数据集中筛选出的包括FAM20A的所有差异基因进行GSEA分析,结果显示以下信号通路参与甲状腺癌的发生发展,其中包括细胞周期有丝分裂、嗜中性粒细胞脱颗粒、通过白介素传递信号白介素4和白介素13信号、细胞通讯、P53下游通路、细胞连接组织、非整合素膜Ecm相互作用、Tap63通路、甲状腺素生物合成等(图4A)。STRING数据库的结果分析显示,10个与FAM20A相互作用的蛋白分别有PEAK1、FAM198A、FJX1、FAM198B、FAM20C、FAM83H、SGK223、AMBN、ENAM、WDR72(图4B)。

图4 GSEA分析以及FAM20A的相互作用蛋白Figure 4 GSEA analysis and interacting proteins of FAM20A

2.5 甲状腺癌与良性甲状腺结节组织FAM20A免疫组化染色结果

17例甲状腺癌和12例良性甲状腺结节对照组织进行免疫组化染色,结果显示与良性甲状腺结节组相比,FAM20A在甲状腺癌中的表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.001)(图5)。

图5 FAM20A在甲状腺癌和良性甲状腺结节中的免疫组化染色及阳性面积统计分析Figure 5 Immunohistochemical staining and statistical analysis of FAM20A positive area in TC and benign thyroid nodules Note:**P<0.01,when compared with benign thyroid nodules.

3 讨论

根据全球癌症统计,全球每年发生58.6万例甲状腺癌,且发病率呈上升趋势[6-7]。甲状腺癌目前通过超声及针吸活检诊断,然而,甲状腺活检在细胞学上不确定的比例高达25%[8]。故对甲状腺活检结果不确定的患者积极进行分子标记物评估可协助明确甲状腺癌的风险和管理策略[9]。探索甲状腺癌关键分子标志物有助于早期诊断、预后评估和复发监测,降低侵入性手术带来的危害。FAM20A蛋白最初是从造血细胞中鉴定出来的,目前被报道参与肝癌、甲状旁腺癌的发生发展[3-5]。但关于FAM20A是否参与甲状腺癌的发生目前仍不明确。

本研究利用TCGA数据库分析发现FAM20A在甲状腺癌中显著升高,且ROC曲线分析结果提示FAM20A对甲状腺癌具有较高的诊断价值。为了进一步探索甲状腺癌组织中FAM20A表达的差异,对GEO数据库GSE205733数据集信息分析结果提示甲状腺癌组织中FAM20A表达高于正常甲状腺组织样本。最后,通过甲状腺癌及良性甲状腺结节组织临床样本进行免疫组化染色,也证实FAM20A在甲状腺癌中的高表达。本研究结果提示FAM20A可作为诊断甲状腺癌的潜在分子标记物。

FAM20A属于FAM20家族之一,FAM20A最早是在牙釉质发育不全的疾病中被鉴定出来的,是一种假激酶[3],通过非催化机制的信号传递发挥功能[10]。假激酶的突变和表达失调与很多疾病发生发展相关,如癌症、神经系统疾病、代谢性疾病和自身免疫性疾病等[10-11]。另外,FAM20A是一种分泌蛋白[12],能够释放到血液循环中在生理、病理系统中起着重要作用。我们对包含FAM20A等的差异基因进行GSEA富集分析,结果显示主要富集在细胞周期有丝分裂、嗜中性粒细胞脱颗粒、通过白介素传递信号白介素4和白介素13信号、细胞通讯、P53下游通路、细胞连接组织、非整合素膜Ecm相互作用、Tap63通路、甲状腺素生物合成等通路上。目前研究提示多种恶性肿瘤发生过程与p53信号通路的失调基因相关[13-15],p53信号通路是一个复杂的细胞应激反应网络,具有多种不同的输入和下游输出,与其作为肿瘤抑制通路的作用相关,p53发挥作用的生物学过程是参与细胞周期阻滞、衰老、DNA修复和细胞凋亡[16]。这提示今后研究中进一步深入探索FAM20A是否通过p53信号通路调控甲状腺癌的发生发展。

综上所述,FAM20A有望成为甲状腺癌的一种新的诊断性生物标志物,且FAM20A可能成为潜在的治疗靶点。鉴于FAM20A是一种分泌蛋白[12],在今后的研究中,将进一步探索FAM20A在血液循环中的表达水平,评估其对诊断、治疗的价值,为甲状腺癌诊疗提供新的分子机制。