响应面优化超声辅助提取青椒叶多酚工艺及抗氧化研究

蓝 志 福

(漳州职业技术学院 继续教育学院,福建 漳州 363000)

青椒(CapsicumannuumL.)也称为灯笼椒或柿子椒,为茄科辣椒属草本植物,起源于中南美洲的热带地区,现在已经在全国各地广泛种植[1-2]。青椒的根、茎、叶、果实中含有多种天然有效成分,包括黄酮、多酚和生物碱等,这些成分具有多种生物生理功能[3-4]。其中,多酚是一种广泛存在于植物果实、皮、叶、根和茎等部位中,含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素的复杂次生代谢物。多酚具有抗癌、抗病毒、抗氧化、改善人体免疫力、防止动脉硬化、降低血脂血糖等多种生理功能,广泛应用于食品、化工、农业和医药等领域[5-6]。然而,目前尚未有青椒叶多酚提取的相关报道。随着科技的不断发展,超声波辅助技术在植物提取方面的优势越来越显著。利用超声波产生的高加速度、猛烈振动、剧烈的空化作用、热效应以及搅拌作用等能够使植物有效成分更易进入溶剂,具有省时、节能、高效和操作简单的特点[7-8]。该研究以青椒叶为原料,以多酚提取率为指标,利用超声辅助法对青椒叶多酚进行提取,并使用响应面对提取工艺进行优化,同时,评价青椒叶多酚的抗氧化活性。该研究为青椒叶多酚资源的深入研究及青椒叶抗氧化剂的开发利用提供了参考和指导。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

青椒叶采自福建省漳州市诏安县西潭镇,乙醇为食品级,产自河南汉永酒精有限公司。没食子酸,分析纯,购自无锡市亚泰联合化工有限公司;硫酸锂、钼酸钠、钨酸钠等均为市售分析纯试剂。

超声波清洗机(KQ250DE),购自昆山市超声仪器有限公司;紫外可见分光光度计(UV-1800PC-DS2),购自上海美谱达仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多酚含量的测定

采用福林酚法[9]在可见光区的765 nm处测定青椒叶多酚溶液的吸光度,并利用吸光度与浓度之间的关系绘制标准曲线并回归得到回归方程。通过回归方程,计算出试验中青椒叶多酚的提取率。

(1)

式中,b为多酚质量浓度,mg/mL,V为定容后提取液体积,mL,m为青椒叶质量,g。

1.2.2 青椒叶多酚的提取工艺

采摘新鲜的青椒叶,用清水洗净,再用蒸馏水淋洗,晾干。将晾干后的青椒叶在50 ℃烘箱中烤干,再使用粉碎机对其进行粉碎和过筛,备用。将1 g青椒叶粉末放入烧瓶中,并按照预设的工艺条件,置于超声波清洗机中进行提取。待提取结束后,通过过滤、浓缩和定容等步骤处理样品,得到青椒叶多酚提取液。根据式(1)计算出青椒叶多酚的提取率,并进行3次平行重复试验,取平均值作为最终结果。

1.2.3 单因素试验

该试验将乙醇浓度、超声时间、液料比和超声温度作为考察因素,研究各工艺对青椒叶多酚提取率的影响。具体工艺如下:设定超声时间40 min、液料比25∶1 (mL∶g)和超声温度70 ℃,改变乙醇浓度(分别选取50%、60%、70%、80%和90%)来考察;设定乙醇浓度70%、液料比25∶1 (mL∶g)和超声温度70 ℃,改变超声时间(分别选取20、30、40、50、60 min)来考察;设定乙醇浓度70%、超声时间40 min和超声温度70 ℃,改变液料比(分别选取15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 (mL∶g)来考察;设定乙醇浓度70%、超声时间40 min和液料比25∶1 (mL∶g),通过改变超声时间(65、70、75、80、85 ℃)来考察。

1.2.4 响应面试验设计

为了探究乙醇浓度、超声时间、液料比和超声温度等4个单因素对青椒叶多酚提取的影响,该研究采用Box-Behnken实验设计方法,在Design-Expert 8.05b软件中建立4因素3水平的试验方案(表1)。

表1 Box-Behnken因素和水平表

1.2.5 抗氧化性能测试

1) DPPH自由基清除率的测定

取2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液加入2 mL蒸馏水,混合均匀后测定其在517 nm处的吸光度,记为A0;取2 mL不同浓度的青椒叶多酚溶液,分别加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液,混合均匀30 min,在517 nm处测定吸光度,记为Ai;取2 mL不同浓度的青椒叶多酚溶液,加入2 mL乙醇,混合均匀后测定517 nm处的吸光度,记为Aj。以抗坏血酸为对照,计算对DPPH自由基的清除率。

2) OH自由基清除率的测定

取2 mL不同浓度的青椒叶多酚溶液,分别加入2 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液和1 mL的9 mmol/L FeSO4溶液,继续加入1 mL 0.01% H2O2溶液混合均匀后反应60 min,定容,并测得在510 nm处的吸光度,记为Ai。以蒸馏水代替H2O2溶液为对照组,测得吸光度,记为Aj,以蒸馏水代替青椒叶多酚为空白组,测得吸光度记为A0,计算对OH自由基的清除率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度的影响

由图1可知,青椒叶多酚的提取率随着乙醇浓度的增加而逐渐增加,并在乙醇浓度为70%时达到峰值。这是因为随着乙醇浓度的上升,溶剂极性降低,导致其更容易破坏植物体内的氢键结构,使得多酚类物质更容易溶解出来。但当乙醇浓度过高时,乙醇会溶解其他一些醇溶性杂质,并与多酚类物质竞争乙醇中的溶解位点,从而降低多酚的提取率[10]。因此,选择乙醇浓度为70%。

图1 乙醇浓度对多酚提取率的影响

2.1.2 超声时间的影响

由图2可知,青椒叶多酚的提取率随着超声时间的延长而逐渐增加,并在超声时间为40 min时达到峰值。这是因为随着超声时间的延长,震荡和剪切作用使植物颗粒内部的多酚类物质逐渐释放。但当超声时间达到40 min时,多酚的提取率反而下降,这是由于大部分多酚类物质已经被释放出来,进一步延长超声时间会促进多酚类物质氧化分解,损失提取效率[11]。因此,选择超声时间为40 min。

图2 超声时间对多酚提取率的影响

2.1.3 液料比的影响

由图3可知,青椒叶多酚提取率随着液料比的增加而逐渐增加,并在液料比为25∶1(mL∶g)时达到峰值。这是因为液料比的增加将加大溶剂对青椒叶颗粒中多酚类物质的浸泡程度,从而增加了多酚与溶剂之间的浓度差。但当液料比过大时,虽然多酚类物质更易溶于大量的溶剂中,但在后续的浓缩过程中会造成大量的多酚类物质流失和损失[12-13],从而降低提取效率。因此,选择液料比为25∶1(mL∶g)。

图3 液料比对多酚提取率的影响

2.1.4 超声温度的影响

由图4可知,青椒叶多酚提取率随着超声温度的升高而逐渐增加,并在超声温度为70 ℃时达到峰值。这是因为提取体系温度的升高会加速分子的热运动,有效促进青椒叶颗粒中多酚类物质向溶液中的传质和扩散,从而提高了多酚的溶解度和提取效率。但当超声温度过高时,部分多酚类物质会发生氧化反应,破坏其结构和活性,降低了提取率[14]。因此,选择超声温度为75 ℃。

图4 超声温度对多酚提取率的影响

2.2 响应面优化结果

2.2.1 响应面设计方案及分析

该研究采用Box-Benhnken试验设计方法,进行青椒叶多酚提取率的研究。共进行了29组试验,得到其多酚提取率数据见表2。随后,利用Design Expert 8.05b软件对这29组数据进行响应面分析,得到方差分析结果如表3所示。

表2 Box-Behnken试验设计

表3 方差分析

对表2中的试验数据进行分析,得到适合该研究的青椒叶多酚提取率(Y)作为响应值,以及乙醇浓度(A)、超声时间(B)、液料比(C)和超声温度(D)4个因素作为自变量的四元二次回归模型:

Y=67.57+1.25A+0.47B-0.37C+2.19D+0.61AB+1.26AC+0.05AD+2.02BC+4.05BD-0.45CD-7.07A2-8.65B2-7.98C2-11.63D2.

根据表3的方差分析结果,该四元二次回归模型具有极显著的水平,表明该模型能够准确地预测不同处理条件下的多酚提取率。同时,相关系数R2为0.906 7,说明该模型的预测值与实验值之间具有高度的相关性,约90.67%的试验数据能够被该模型成功解释和预测。此外,失拟项F=5.28,P=0.061 4>0.05,说明该模型中随机误差较小,即响应面模型能够很好地拟合试验数据。通过F及P值得出影响不显著的因素为一次项A、B、C和交互项AB、AC、AD、BC、CD;影响显著为超声温度的一次项D和超声时间和超声温度的交互项BD;影响极显著为二次项A2、B2、C2、D2,说明青椒叶多酚提取率受多个工艺因素的非线性影响,需要考虑相互作用。超声温度对多酚提取率的影响最大,其次是乙醇浓度、液料比和超声时间。因此,在优化青椒叶多酚提取工艺时,需要重点控制超声温度。综上所述,该研究的回归模型准确性和可信度高,可用于青椒叶多酚的提取分析和预测。通过对该回归模型进行拟合和优化,可以找到最佳的处理方案,以达到高效、经济地提取青椒叶多酚的目标。

响应面分析用于研究多个因素对某个响应变量的影响[15],在该研究中,考察了乙醇浓度、超声时间、液料比和超声温度4个因素对青椒叶多酚提取率的影响,并绘制了响应面和等高线图,以直观地展示各因素之间的交互作用对青椒叶多酚提取率的显著性程度。由图5～10可以看出,响应面曲线最陡的是超声时间和超声温度,其等高线偏离圆形也最厉害,说明对青椒叶多酚提取率影响最显著的是超声时间和超声温度的交互作用;而响应面曲线陡度次之的是超声时间和液料比,其等高线偏离圆形的程度次之,说明超声时间和液料比交互作用的显著程度次之。同理可得,各因素交互作用影响的显著性顺序为BD> BC> AC> AB> CD> AD。这些发现对于优化青椒叶多酚提取过程具有重要意义,可为相关领域的研究提供有力的支持。

图5 乙醇浓度和超声时间交互作用对多酚提取率的影响

图6 乙醇浓度和液料比交互作用对多酚提取率的影响

图7 乙醇浓度和超声温度交互作用对多酚提取率的影响

图9 超声时间和超声温度交互作用对多酚提取率的影响

2.2.2 最优条件验证

经过回归方程计算,提取青椒叶多酚的最佳工艺为乙醇浓度70.89%,超声时间40.53 min,液料比24.94∶1(mL∶g),提取温度70.52 ℃。在此工艺条件下,青椒叶多酚提取率预测值可达到67.76 mg/g。为了验证模型预测的可靠性,根据实验操作的便利性,将各因素工艺条件修正为乙醇浓度71%,超声时间41 min、液料比25∶1 (mL∶g)和提取温度71 ℃,并进行3次试验。试验结果表明,青椒叶多酚的提取率平均值为67.62 mg/g。与模型预测值相比,其相对误差仅为0.21%,证明基于响应面分析方法优化青椒叶多酚提取工艺的有效性和可行性[16]。这一研究成果为青椒叶多酚的提取和开发提供了新的思路和方向,具有重要的理论和实践价值。

2.3 青椒叶多酚的抗氧化能力

2.3.1 多酚对DPPH自由基的清除效果

青椒叶多酚和抗坏血酸的抗氧化能力可以通过对DPPH自由基的清除率来进行评估[17](图11)。结果表明,随着青椒叶多酚和抗坏血酸质量浓度的增加,对DPPH自由基的清除率也逐步升高。尤其是在青椒叶多酚质量浓度为100 mg/L时,其清除率可达到78.21%,显示出其强大的DPPH自由基清除能力。此外,青椒叶多酚和抗坏血酸对DPPH自由基清除率的半抑制质量浓度(IC50)分别为56.34和46.79 mg/L,说明青椒叶多酚能够有效地抵抗氧化作用,并且其抗氧化活性与多酚浓度呈正相关。

图11 抗坏血酸和多酚对DPPH自由基的清除效果

2.3.2 多酚对OH自由基的清除效果

青椒叶多酚和抗坏血酸的抗氧化能力可以通过对OH自由基的清除率来进行评估(图12)。结果表明,随着青椒叶多酚和抗坏血酸质量浓度的增加,对OH自由基的清除率也逐步升高,尤其是青椒叶多酚质量浓度为250 mg/L时,其清除率可达到80.41%,显示出其强大的OH自由基清除能力。此外,青椒叶多酚和抗坏血酸对OH自由基清除率的IC50分别为125.20和96.14 mg/L,说明青椒叶多酚能够有效地抵抗氧化作用,并且其抗氧化活性与多酚浓度呈正相关。

图12 抗坏血酸和多酚对OH自由基的清除效果

以上试验结果为青椒叶多酚的抗氧化能力提供了可靠的科学依据,为其在保健品和食品工业等领域的应用提供了参考。

3 结论

该研究使用超声波辅助法提取青椒叶多酚,通过单因素试验和响应面法分析,建立了多酚提取率和考察工艺之间的回归模型。最终,优化得出了提取多酚的最佳工艺条件为:乙醇浓度71%、超声时间41 min、液料比25∶1(mg∶L)和提取温度71 ℃,并进行了3次实验,青椒叶多酚的提取率平均值为67.62 mg/g。与模型预测值相比,其相对误差仅为0.21%,基于响应面分析方法,成功地优化了青椒叶多酚的提取工艺,并证明了该方程的有效性和可行性。青椒叶多酚能够有效地抵抗氧化作用,并且其抗氧化活性与多酚浓度呈正相关,青椒叶多酚和抗坏血酸对DPPH自由基清除率的半抑制质量浓度IC50分别为56.34和46.79 mg/L,对OH自由基清除率的半抑制质量浓度IC50分别为125.20和96.14 mg/L,该研究为青椒叶多酚的抗氧化能力提供了可靠的科学依据,为其在保健品和食品工业等领域的应用提供了参考。