绣球菌多糖粗提物对小鼠抗疲劳作用的研究

李佳鑫, 丁兰卉, 李 姣, 匡 明,2, 金永燮,2*

(1.吉林农业科技学院 食品工程学院;2.吉林省酿造技术科技创新中心:吉林 吉林 132101)

绣球菌(Sparassiscrispa),又名绣球蕈、绣球菇,隶属于担子菌亚门、异隔担子菌纲、无(非)褶菌目、绣球菌科、绣球菌属,因其形似巨大绣球而得名[1]。绣球菌是一种营养丰富,功效作用强大,非常珍稀名贵的野生食用菌,不仅味道鲜美,营养价值高,子实体中含有的β-葡聚糖可以提高人体免疫力、强化机体造血功能,而且还具有抗癌、防癌、抗艾滋病等功效[2-6]。近年来,由于它具有免疫调节、提高造血功能等功效,而逐渐成为研究热点,通过深层次研究,挖掘出绣球菌的更多应用价值。

多糖分布广泛,在高等植物、细菌、真菌[7],藻类以及动物体内含量丰富。多糖除具有免疫调节功能外还具有抗病毒、抗感染、抗辐射、抗凝血、降血糖、降血脂、消除氧化自由基[8],促进核酸与蛋白质的生物合成等作用[9]。多糖已被认为是除核酸和蛋白质之外另一重要的生命物质。对多糖生物活性的研究越深入,多糖的生物活性机制及功效因子会更加明确, 应用领域也会更加宽广[10]。

绣球菌多糖提取物的抗疲劳作用和机制尚不明确,该研究通过建立力竭运动小鼠模型来考察绣球菌多糖的抗疲劳作用及机制,以期揭示绣球菌多糖作为新型营养补充剂的开发价值。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

1) 实验动物:健康ICR小鼠,雄性,5周龄,体质量22～24 g,40只,购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司,实验动物生产许可证号:SCXK(吉)2020—0002,质量合格证号:01021686806305570。动物实验严格遵循动物伦理原则,经吉林农业科技学院实验动物伦理委员会批准(审批号:20231023)。

2) 绣球菌:市售;绣球菌多糖:自提;乳酸(lactic acid,LD)、糖原(glycogen,GLY)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)测定试剂盒:南京建成生物工程研究所有限公司;肌酸激酶(creatine kinase ,CK)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)测定试剂盒:深圳迈瑞动物医疗科技有限公司。

1.2 仪器与设备

高速离心机(TG16-WS):长沙东旺实验仪器有限公司;超低温保存箱 (DW-86L388A):青岛海尔特种电器有限公司;台式歧管式冻干机(BTP-3ESE0X):美国SP SCIENTIFIC公司;电子分析天平(ES-E210B):天津市德安特传感技术有限公司;转棒疲劳仪(SA102):江苏赛昂斯生物科技有限公司;小动物游泳桶(SA):江苏赛昂斯生物科技有限公司;动物跑台(SA101B):江苏赛昂斯生物科技有限公司;全自动生化分析仪(BS-240VET):深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;酶标仪(INFINITE 200 PRO):美国SP SCIENTIFIC 公司。

2 方法

2.1 绣球菌多糖的制备

工艺流程:新鲜绣球菌→洗净→切块→干燥→粉碎→过筛→称取绣球菌干粉→加入蒸馏水→超声波萃取→收集提取液→减压抽滤浓缩→醇析→离心→冷冻干燥→绣球菌多糖

2.2 分组及给药

分组及灌胃:40只小鼠标准饲料喂养,温度(23±1) ℃,相对湿度(50±5)%,明暗周期12 h,标准颗粒饲料喂养。小鼠于实验环境条件下适应1周后,随机分为绣球菌多糖提取物高400 mg/kg(H)、中200 mg/kg(M)、低100 mg/kg(L)剂量组和对照组(C),每组10只。高、中、低3组的提取物溶液于每日指定时间灌胃,灌胃体积10 mL/kg。对照组给予等体积生理盐水灌胃,连续灌胃32 d,灌胃后第20天开始进行小鼠爬杆练习,第22天正式进行爬杆试验;从第23天开始进行跑台力竭试验,共7 d;第31天进行小鼠负重游泳试验,其间小鼠自由摄食和饮水[11]。

2.3 抗疲劳试验

第22天灌胃绣球菌多糖提取物溶液30 min后,把40只小鼠放到铁架台的最上端,使小鼠的四肢肌肉处于紧张状态。并记录小鼠跌落的时间,在第3次跌落后结束爬杆试验,3次跌落时间的平均值则为小鼠的爬杆时间。根据爬杆试验评估多糖提取物溶液对小鼠耐力的影响[12]。第23天灌胃绣球菌多糖提取物溶液30 min后,对4组小鼠进行跑台力竭试验,并记录小鼠力竭时间,跑台力竭试验进行7 d。根据跑台力竭试验评估多糖提取物溶液对小鼠耐力的影响[13]。最后1 d测定完跑台力竭实验后休息1 d,每组随机取小鼠2只进行力竭游泳试验。在小鼠尾根部负荷铅皮,其重量约为小鼠体重的5%,小鼠放于游泳箱(水深约30 cm,水温约25 ℃),保持小鼠四肢运动,每次训练30 min。小鼠入水开始计时,当小鼠头部入水7 s而不能自行浮出水面为体力耗竭,计时结束,此段时间记为小鼠游泳时间。根据力竭游泳试验评估多糖提取物溶液对小鼠耐力的影响[14]。

2.4 抗疲劳指标检测

第32天给予受试物40 min后,将各组小鼠置于水温30 ℃的自制游泳箱,不负重游泳30 min捞出,休息30 min后立即断头采血,使用离心机3 500 r/min离心 15 min,分离血清备用;采血后的小鼠立即摘取肝脏备用,分析仪按照测试盒说明测定BUN[15],CK,LDH含量[16]。分别称取一定量的肝脏置于15 mL 玻璃匀浆管内,生理盐水漂洗后处理,超声粉碎制得10%组织匀浆,按照试剂盒说明测定肝糖原、乳酸含量[17]。

2.5 数据处理与分析

采用SPSS 20版本数据统计软件进行数据分析,采用单因素方差分析,数据结果采用平均值±标准差表示,当P<0.05时数据有显著性差异,当P<0.01时数据有极显著性差异。

3 结果与分析

3.1 绣球菌多糖对小鼠体质量的影响

小鼠体质量的变化可以直接反映小鼠生长发育状态,也可以间接体现绣球菌多糖在饲养期间对小鼠的体质量影响。各组小鼠体质量变化如图1所示。

图1 各组小鼠体质量变化情况

适应性喂养1周后各组小鼠体质量均有所升高,为(25.94±0.97) g,由图1可知,在绣球菌多糖灌胃期间各组小鼠体质量逐渐增长且与对照组小鼠无明显差异;小鼠日常活动无影响,毛发无明显脱落,眼神有光泽,四肢伸展正常,说明绣球菌多糖对其生长发育无不良影响。

3.2 绣球菌多糖对小鼠力竭运动时间的影响

爬杆试验,跑台试验,负重游泳试验是测试小鼠体能、耐力、运动损伤等重要的试验方法,也是评价小鼠抗疲劳的最有效方法[16]。此次试验通过评估小鼠力竭时间来判断绣球菌多糖对小鼠抗疲劳的影响,小鼠力竭时间如表1所示。

表1 各组小鼠力竭时间

由表1可知,低(L)、中(M)、高(H)剂量组的小鼠平均爬杆时间均高于对照组(C),中剂量组(L)具有显著性差异(P<0.05),高剂量组(H)具有极显著性差异(P<0.01)。在小鼠跑台体能测试中,与对照组(C)相比,低剂量组(L)、中剂量组(M)和高剂量组(H)的小鼠跑台时间逐步增加。其中,与对照组(C)相比,低剂量组(L)、中剂量组(M)和高剂量组(H)分别具有极显著性差异(P<0.01)。在小鼠力竭游泳实验中,与对照组(C)相比,低剂量组(L)、中剂量组(M)、高剂量组(H)的小鼠游泳时间逐渐增加。与对照组(C)相比,低剂量组(L)具有显著性差异(P<0.05),中剂量组(M)和高剂量组(H)均具有极显著性差异(P<0.01)。说明绣球菌多糖可以增加小鼠耐力,延长小鼠力竭时间,有明显的抗疲劳作用,且力竭时间随着绣球菌多糖灌胃浓度升高而延长。

3.3 绣球菌多糖对小鼠力竭运动后体内肝糖原含量的影响

当糖原不能被机体直接吸收时糖原会储存在机体肝细胞中,当机体运动强度增加时肝糖原降解成葡萄糖维持机体系统平衡,为机体运动提供能量,抵抗疲劳。因此,测试小鼠机体内的肝糖原含量可有效反应小鼠运动抗疲劳状况。经过检测,小鼠力竭运动后的体内肝糖原含量如图2所示。

注:**表示与对照组相比差异极显著,P<0.01,下同。

由图2可知,小鼠力竭运动后不同绣球菌多糖剂量组与比对照组相比,肝糖原有所增加,与对照组(C)相比绣球菌多糖低剂量组(L)并无明显差异性(P>0.05),但绣球菌多糖中剂量组(M)具有极显著差异(P<0.01)。经过中剂量组与对照组(C)比较,可以证明绣球菌多糖能有效堆积肝糖原,提高小鼠的抗疲劳能力。

3.4 绣球菌多糖对小鼠力竭运动后肝组织中乳酸含量的影响

当机体处于长时间高强度负荷时,机体会在运动开始时产生大量乳酸,但随着时间流逝,机体耗氧速率达到稳态乳酸生成速率就会下降但仍会产生堆积。乳酸堆积直接引起运动疲劳。小鼠力竭运动后体内乳酸含量可以反映出绣球菌多糖对缓解小鼠运动疲劳的能力。经过检测小鼠力竭运动后肝组织中的乳酸含量如图3所示。

图3 各组小鼠乳酸含量情况

由图3可知,与对照组(C)相比,绣球菌多糖各剂量组的乳酸含量呈现下降趋势,其中,绣球菌多糖低剂量组(L)的乳酸含量与对照组(C)相比,减少且呈极显著差异(P<0.01),绣球菌多糖中剂量组(M)的乳酸含量比低剂量组(L)少且和对照组(C)具有极显著差异(P<0.01),绣球菌多糖高剂量组(H)与其他3组相比,乳酸含量最少且和对照组(C)具有极显著差异(P<0.01)。以上情况可有效反映绣球菌多糖能缓解乳酸堆积状况,具有抗疲劳作用且随着绣球菌多糖浓度增高效果更加明显。

3.5 绣球菌多糖对小鼠力竭运动后血清中乳酸脱氢酶含量的影响

在机体剧烈运动中机体体内的乳酸脱氢酶含量会逐渐增加,机体产生乳酸需要乳酸脱氢酶缓解,在细胞缺少氧气供应的情况下要让机体持续供能就要由乳酸脱氢酶释放氢以产生NAD+来制造ATP,保证运动进行。经过检测小鼠力竭运动后血清中乳酸脱氢酶含量来判断绣球菌多糖对小鼠运动耐力的影响。经检测小鼠血清中乳酸脱氢酶含量如图4所示。

由图4中可以看出,与对照组(C)相比,其他绣球菌多糖剂量组的乳酸脱氢酶含量均有所升高,其中,绣球菌多糖中剂量组(M)与对照组(C)具有显著性差异(P<0.05)。绣球菌多糖低剂量组(L)和中剂量组(M)之间的LDH含量差异较小,绣球菌多糖高剂量组(H)由于运动损伤导致个体差异较大使标准差数值较大,不具有显著性差异。经过分析,可以推测出绣球菌多糖对小鼠抗疲劳运动具有缓解作用。

3.6 绣球菌多糖对小鼠力竭运动后血清中肌酸激酶含量的影响

肌酸激酶在机体中促进能量代谢,比如促进ATP(三磷酸腺苷)转化成ADP(二磷酸腺苷),在小鼠力竭运动过程中肌酸激酶促进生成磷酸肌酸,其具有的高能磷酸键是肌肉收缩的能量来源,所以检测小鼠血清中的肌酸激酶含量可以解释绣球菌多糖在小鼠力竭运动中起到的抗疲劳作用。经检测小鼠血清中肌酸激酶含量如图5所示。

从图5可以看出,各组小鼠血清中的肌酸激酶含量呈上升趋势,对照组(C)和绣球菌多糖低剂量组(L)、中剂量组(M)均不具有显著差异,但对照组(C)和绣球菌多糖高剂量组(H)具有显著性差异(P<0.05),且随着绣球菌多糖剂量的增加各组小鼠血清中肌酸激酶的含量也有所上升。经过分析,可以推测绣球菌多糖对小鼠力竭运动具有抗疲劳作用。

3.7 绣球菌多糖对小鼠力竭运动后血清尿素氮含量的影响

当机体经过长时间运动而无法提供足够多的糖、脂肪来分解代谢提供能量时,蛋白质和氨基酸的分解会逐渐加强,机体中血清尿素氮会随运动增多,机体越无法承受运动负荷,尿素氮会堆积更多。血清尿素氮含量也从侧面反映出机体的运动耐力,此试验通过检测血清尿素氮来解释绣球菌多糖对小鼠的抗疲劳作用,经检测血清尿素氮含量如图6所示。

图6 各组小鼠尿素氮含量情况

通过观察图6发现,各小组的血清尿素氮呈下降趋势,其中,绣球菌多糖低剂量组(L)、中剂量组(M)、高剂量组(H)均与对照组(C)有极显著差异(P<0.01)。随着绣球菌多糖剂量浓度的增加,各组小鼠的血清尿素氮含量降低,体现出绣球菌多糖对小鼠力竭运动具有一定的抗疲劳作用。

4 结论与讨论

疲劳是一种日常普遍但未受到高度重视的疾病状态。常用的抗疲劳试验方法有负重游泳试验[18]、爬杆试验、Morris水迷宫实验等;生化指标有乳酸、尿素氮、糖原、肌酸激酶等用来评价疲劳程度及抗疲劳功效的判断[19]。该研究发现,绣球菌多糖可有效增加小鼠运动时间,且随着绣球菌多糖摄入量的增加,效果越明显。经过数据分析,推测出绣球菌多糖可增加小鼠机体内的糖原储量,小鼠进行运动时身体中有足够的糖原消耗[20],能增加运动时间,缓解疲劳状态,提升耐力[21]。绣球菌多糖可以减少小鼠运动过程中产生的乳酸,乳酸堆积引起疲劳[22],所以绣球菌多糖能减缓小鼠的疲劳速度达到抵抗疲劳。绣球菌多糖能提高乳酸脱氢酶和肌酸激酶的活性,在储存能量的同时乳酸脱氢酶还能降解乳酸减缓疲劳,阻止蛋白消耗减少血尿素氮的产生[23]。

在肝糖原检测时,高剂量组(H)肝糖原含量比其他实验组低,推测原因是小鼠在抗疲劳试验中运动时间过长导致肝损伤[24],经过一周的抗疲劳试验小鼠肝损伤状态堆积,处死当天没有充分恢复状态导致肝糖原检测数据低。

综上所述,绣球菌多糖可以明显提高小鼠跑台力竭时间、负重游泳力竭时间、爬杆力竭时间,增加体内糖原储备,减少体内乳酸生成,提高乳酸脱氢酶、肌酸激酶活性,降低体内血尿素氮含量,有效提高机体运动耐力,增加机体抗疲劳能力。