绿球藻多糖抗氧化和复合保鲜液对冷鲜猪肉保鲜效果研究

李 昕, 杨 月, 姜成哲

(1.吉林职业技术学院,吉林 龙井 133400;2.延边大学农学院,吉林 延吉 133002)

绿球藻为天然碱性供人食用的原材料,对身体健康具有极大益处,此外,绿球藻的作用还十分广泛,不仅在食品、药品领域中具有重要作用,在化妆品、保鲜制剂、废水处理中也具有良好性能[1]。绿球藻多糖在医疗药物研发方面,如调节免疫、降血糖血脂等已然成为热点[2-3]。

绿球藻在保鲜方面具有较好的抗氧化功能,有延长保质期的功效[4]。此外,绿球藻还能去除废水中的重金属离子,因为绿球藻的细胞膜上存在一种特殊物质,经研究发现,这种特殊的物质就是多糖,蛋白质中的官能团可以与重金属离子结合,在结合之后,就可以吸附金属离子,绿球藻细胞膜跟其他质膜具有高度选择透过性,这种特性从某种程度上决定了绿球藻细胞膜能去除重金属离子[5]。

壳聚糖(Chitosan,CTS)又称为壳多糖、脱乙酰基甲壳素、可溶性甲壳质、壳糖胺、几丁聚糖等,化学名称为2-氨基-β-1,4-葡聚糖,是由甲壳素(Chitin)经脱乙酰作用的产物,也是目前生物界中发现的唯一的天然碱性多糖[6]。含有游离的氨基和羟基的天然高分子聚合物,具有较好的成膜性能和抑菌效果[7]。化学反应比较强烈,可与多种物质反应,因此具有更多的生物学作用,可在多领域中得到应用。刘利萍等[8]利用壳聚糖降解后的肉样进行了涂膜,结果表明,降解后的壳聚糖比未降解的壳聚糖具有更好的抑菌作用,熟猪肉6 d仍能保持较好的颜色和香味,而且菌落总数均符合国家规定。Desvit等[9]研究表明,在室温下,壳聚糖和稻壳烟液混合处理的肉丸对大肠杆菌的抑制范围为6.49～7.07 mm,对沙门氏菌的抑菌圈为6.52～7.26 mm。

海藻糖是一种还原性双糖[10],是由2个吡喃型葡萄糖单体通过α,α-1,1-糖苷键连接而成的双糖[11],具有稳定生物大分子的作用,因其优异的稳定性、安全性、低吸湿性被广泛应用于食品行业。

该研究以绿球藻为原材料,结合壳聚糖和海藻糖作为复合保鲜液对冷鲜猪肉的保鲜效果进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

绿球藻:由延边大学生物技术实验室培养。

三氟乙酸、氯化钠、氯仿、无水乙醇、甲醇、水杨酸、过氧化氢、邻苯三酚、过硫酸钾、DPPH(2,2-联苯基-1-苦基肼基)、Vc、ABTS[2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐]、壳聚糖等均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;海藻糖,购自青岛东孚美伦生物科技有限公司;冷鲜猪肉,购自亿品生鲜超市。

1.2 仪器与设备

UV759紫外-可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司);K9840自动凯式定氮仪(济南海能仪器股份有限公司);HCB-1300V洁净工作台(青岛海尔特种电器有限公司);SHA-B恒温振荡器(常州国华电器有限公司);MLS-3780高压蒸气灭菌锅(日本三洋电机株式会社);PHS-25数显pH计(上海仪电仪器股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 绿球藻多糖的制备

准确称取一定量的绿球藻粉→加适量的去离子水→热水浸提→离心(3 500 r/min,15 min)→取上清→离心(3 500 r/min,15 min)→取上清用旋转蒸发仪70 ℃下浓缩至原体积的 1/3→按3∶1体积比加入氯仿-正丁醇溶液(4∶1,体积比),沉淀蛋白2次→按体积比1:3加入85%乙醇醇沉→4 ℃过夜→离心(3 500 r/min,15 min)→沉淀冷冻干燥→绿球藻多糖[12]。

1.3.2 绿球藻多糖含量的测定

1.3.2.1 葡萄糖标准曲线

准确称取0.1 g葡萄糖于100 mL烧杯中,将标准葡萄糖工作液加入水中,定容到1 000 mL,分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL,将其置于20 mL具塞式玻璃试管中,各以蒸馏水补至1 mL。然后向试液中加入1 mL 5%苯酚溶液,然后快速加入浓硫酸5 mL(沿试管壁缓缓加入,以防混合液溅出),盖好盖子上下反复摇匀冷却10 min,然后将试管放置于30 ℃水浴显色20 min后,于490 nm测吸光度,采用蒸馏水作为空白对照,以葡萄糖为横坐标,以吸光度为纵坐标,建立了一条标准曲线[13]。回归方程分析如图1所示为标准曲线,y=1.024 4x+0.020 7,R2= 0.999 1。

图1 葡萄糖标准曲线

1.3.2.2 多糖提取率

采用1.3.2的方法,对所提取的绿球藻多糖的吸光值进行测定。利用吴宪玲等[14]的公式:

式中,C为样液中的多糖浓度,mg/g;N为样液稀释倍数;V为提取液的总体积,mL;M为绿球藻多糖的质量,mg。

1.3.3 抗氧化性试验

1.3.3.1 绿球藻多糖DPPH清除能力测定

用Nattinee等[15]方法对绿球藻多糖DPPH清除能力进行研究。将2 mmol/L DPPH-乙醇溶液移入100 mL棕色量瓶中等待备用,避光保存(0～4 ℃),分别精密量取不同质量浓度(1,5,10,15,20 mg/mL)的样液以及空白样液2 mL于具塞管中,分别接入2 mL 2 mmol/L DPPH-乙醇溶液,充分混匀后放置在黑暗环境中避光,反应时间为30 min,在517 nm波长下对其吸光度值进行检测,同浓度Vc做对照,每组试验测量重复3次。按照下列公式计算:

清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×100,

式中,A1为绿球藻多糖样品的吸光度值;A2无水乙醇代替DPPH溶液检测吸光度值为;A0为无水乙醇代替绿球藻多糖溶液检测吸光度值。

1.3.3.2 绿球藻多糖还原能力测定

参照黄仁术等[16]方法对绿球藻多糖的还原能力进行测定。将2.5 mL不同质量浓度(1,5,10,15,20 mg/mL)的样液分别与2.5 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH值6.6)及2.5 mL铁氰化钾(1%)混匀,将混合物在50 ℃水浴中静止20 min,然后加入2.5 mLTCA(10%)终止反应,3 000 r/min离心10 min,取上清液2.5 mL,依次加入2.5 mL无水乙醇和0.5 mL FeCl3(0.1%),混匀后静置10 min,在700 nm处测定吸光度,同浓度Vc做对照,每组实验测量重复3次。按照下列公式计算:

还原力=A1-A2,

式中,A1为绿球藻多糖样品的吸光度值;A2为去离子水代替样品的混合液作为参比溶液的吸光度值。

1.3.3.3 绿球藻多糖羟自由基清除能力测定

参照刘宇琪等[17]水杨酸法进行绿球藻多糖的羟基自由基清除能力的测定。在10 mL试管中依次加入1 mL不同质量浓度(1,5,10,15,20 mg/mL)的样液,加入6 mmol/L硫酸亚铁 2 mL,6 mmol/L水杨酸2 mL,2 mL浓度为4.4 mmol/L的过氧化氢溶液,2 mL过氧化氢为起始反应,在510 nm处对吸收度进行测定,用去离子水取代空白组。同浓度Vc做对照,重复3次。按照下列公式计算:

清除率/%=[(A0-A1)/A0]×100,

式中,A0为空白组吸光度值;A1为绿球藻多糖样品吸光度值。

1.3.3.4 绿球藻多糖超氧阴离子自由基清除能力测定

参照华宁烨等[18]邻苯三酚自氧化法测定绿球藻多糖清除自由基的能力,在10 mL试管中加入500 μL不同质量浓度(0.2,0.4,0.6,0.8,1 mg/mL)的样液,依次加入1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液,pH值为8.3。加入浓度为25 mmol/L邻苯三酚100 μL充分混匀后,在20 ℃水浴条件下放置时间为6 min(试管需加塞),随后立即用0.5 mL浓盐酸终止反应。在420 nm波长下对其吸光度进行检测,用去离子水取代空白组,用磷酸缓冲剂替代试样,以同等浓度Vc作为对照,每个试验测量3次,按照下列公式计算:

清除率/%=[1-(A0-A1)/A2]×100,

式中,A0为绿球藻多糖样品吸光度值;A1为磷酸缓冲溶液替代样液吸光值;A2为去离子水替代绿球藻多糖的吸光度值。

1.3.3.5 绿球藻多糖ABTS自由基清除能力测定

参照骆娟等[19]等的方法测定ABTS自由基清除率。用去离子水配制ABTS溶液(ABTS 7 mmol/L,10 mL)和过硫酸钾溶液(2.45 mmol/L,10 mL)混合,在室温条件下避光16 h后制成ABTS自由基溶液,使混合液在734 nm处吸光度为(0.7±0.03),备用(使用80%乙醇稀释大概31倍得到)。配制不同质量浓度(0.2,0.4,0.6,0.8,1 mg/mL)的样液1 mL,再用ABTS自由基溶液3.9 mL与样液混匀,进行避光反应10 min,在734 nm下测量吸收光度值。用1 mL去离子水替代空白,用相同浓度的Vc作为对照组,每个试验组重复测量3次。根据以下公式来计算:

清除率/%=(A0-A1)/A0]×100,

式中,A0为空白组吸光值;A1为绿球藻多糖样品吸光度值。

1.3.4 复合保鲜处理

使用3 mL复合保鲜剂[20](前期通过单一保鲜液单因素试验及响应面试验最终确定配方比例为:绿球藻多糖1.50%、壳聚糖1.10%、海藻糖0.95%),用无菌一次性手套将试液涂布均匀,11.5 cm×7.5 cm×4.5 cm的透明一次性保鲜盒内,标注,置于4 ℃冰箱内冷藏。

1.3.5 指标测定

1.3.5.1 菌落总数的测定

按照《食品微生物学检验菌落总数测定》(GB4789.2-2016)对其进行了检测。无菌操作称取样品5 g,用灭菌剪刀剪碎,放入装有90 mL 0.85%无菌生理盐水锥形瓶中,封口后摇床振摇3 min,然后取1 mL上清液,进行10倍递增稀释,选择合适的稀释度,倾注平板,倒入PCA培养基,在37 ℃恒温培养箱中恒温培养48 h后计数。

1.3.5.2 挥发性盐基氮值(TVB-N)的测定

采用半微量定氮法,按 GB5009.228-2016 《食品中挥发性盐基氮的测定》进行研究。取5 g肉切碎搅匀,置于锥形瓶中,加100 mL水,不停震摇,浸渍30 min后过滤,滤液置冰箱备用。预先将盛有10 mL 2%硼酸吸收液并加有5～6滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端,并使其下端插入锥形瓶内吸收液的液面下,吸取5.0 mL上述样品滤液于蒸馏器反应室内,加5 mL 1%MgO混悬液,迅速盖塞,并加水以防漏气,通入蒸气,待蒸气充满蒸馏器内时关闭蒸气出口管,由冷凝管出现第1滴冷凝水开始计时,蒸馏5 min即停止,吸收液用0.01 mol/L盐酸标准溶液浓度来进行滴定,终点至蓝紫色。同时做试剂空白试验。

1.3.5.3 pH值的测定

采用《食品pH的测定》(GB5009.237-2016)对其进行了检测。用pH值直测仪测定pH值,在测定前首先需要对设备进行校准,然后把其插入到肉样中进行pH值检测,需要让探头插入肌肉中,深度为2 cm左右,待数值稳定之后,对显示的数值进行读取。平行3次减少试验误差。

1.3.5.4 汁液流失率的测定

参照张俐勤等[21]方法,准确称量样品贮藏前质量M1,每次对肉样进行称量的时候,将汁液吸干,贮藏后质量为M2。

汁液流失率/%=(M1-M2)/M1×100.

1.3.5.5 感官评价

抽取10名感官评定人员,让其评价肉汤、肉样的色泽等。参照杨春婷等[22]的感官评定方法,采用0～4 ℃冷鲜猪肉进行感官评定。评价的标准见表1,8～10分较好,6～8分中等,4～6分为差,低于2分为已经变质。

表1 感官评价表

1.4 数据分析

采用SPSS20.0对数据的显著性进行分析(P<0.05),采用Origin 2018绘作制图。每组试验重复3次取平均值。

2 结果与分析

2.1 绿球藻多糖对抗氧化指标的影响

2.1.1 绿球藻多糖对DPPH清除能力的影响

由图2可以看出,随着质量浓度的提高2个试验组的DPPH清除率也跟着提高,浓度为1 mg/mL时, 绿球藻多糖和Vc的DPPH自由基清除率分别为17.20%和100%,当浓度为15 mg/mL时,绿球藻多糖达到56.93%,当浓度为20 mg/mL时,绿球藻多糖的DPPH自由基清除率达到98.69%。

图2 绿球藻多糖DPPH自由基清除率

2.1.2 绿球藻多糖对还原能力的影响

由图3可知,绿球藻多糖的还原能力随浓度的增大而增大。

图3 绿球藻多糖还原能力

Vc对照组的还原力一直优于绿球藻多糖组。当浓度为1 mg/mL时, 绿球藻多糖还原力为0.07,Vc还原能力为0.72,当浓度达到20 mg/mL时,绿球藻多糖的还原能力达到0.64,对照的还原能力达到1.17,虽然没有Vc组的还原能力强,但结果表明,绿球藻多糖组具有一定的抗氧化能力。

2.1.3 绿球藻多糖对羟自由基清除率的影响

由图4可知,随着质量浓度的上升,2个试验组的羟自由基清除率都呈现上升的趋势,当浓度达到1 mg/mL时,试验组与Vc对照组清除率差别不大,绿球藻多糖清除率为21.80%,Vc清除率为22.54%,但当浓度达到5 mg/mL时,试验组的清除率明显高于对照组,羟基自由基清除率分别为64.99%和 29.25%,这说明绿球藻多糖羟自由基清除效果非常显著。

图4 绿球藻多糖羟自由基清除率

2.1.4 绿球藻多糖对超氧阴离子自由基清除能力的影响

由图5可知,当绿球藻多糖和Vc对照组浓度为1 mg/mL时,2组都达到最高清除率,分别是90.15%和100%,从试验结果可以看出,实验室自养绿球藻多糖的超氧阴离子的清除效果较好。

图5 绿球藻多糖超氧阴离子自由基清除率

2.1.5 绿球藻多糖对ABTS自由基清除能力的影响

由图6可知,随着浓度的升高,绿球藻多糖与对照组Vc的清除能力都在增强,但很明显绿球藻多糖组效果要显著低于Vc组(P<0.05)。当浓度达到1 mg/mL时,绿球藻多糖与阳性对照组ABTS 自由基清除率分别可达80.10%和100.00%。尽管其清除效果远不及 Vc,但仍显示出绿球藻多糖抗氧化性。

图6 绿球藻多糖ABTS自由基清除率

2.2 复合保鲜液对保鲜效果的影响

2.2.1 复合保鲜液对冷鲜肉菌落总数的影响

由图7可知,冷鲜肉菌落总数随贮存时间的延长显著性增加(P<0.05),冷鲜肉0 d时菌落总数为(2.50±0.17) CFU/g,第6天对照组的菌落总数为(6.12±0.11) CFU/g,此时冷鲜肉已腐败变质,而绿球藻多糖处理组和复合处理组的菌落总数分别为(5.24±0.07) CFU/g和(5.01±0.12) CFU/g,显著低于对照组(P<0.05),且在冷鲜肉国标范围内。

图7 复合保鲜液对冷鲜肉菌落总数的影响

但第10天复合保鲜处理组的菌落总数仍在鲜肉范围内,对照组、绿球藻多糖处理组和复合处理组的菌落总数分别为(7.50±0.04)、(5.69±0.05)和(5.34±0.04)CFU/g,表明复合保鲜剂比单独使用绿球藻多糖具有更好的保鲜作用,复合处理组与单一试验组有显著性差异(P<0.05)。

2.2.2 复合保鲜液对冷鲜肉TVB-N值的影响

由图8可知,相对于对照组而言,绿球藻多糖和复合处理组的TVB-N值逐渐升高,对照组0 d时TVB-N值为(5.60±0.06) mg/100 g,第6天为(15.08±0.05) mg/100 g,超过国家标准,第10天对照组、绿球藻多糖处理组和复合处理组的TVB-N值分别为(23.90±0.13) mg/100 g、(13.20±0.11) mg/100 g和(10.50±0.07) mg/100 g,对照组超过国家标准,而复合涂膜处理的冷鲜肉仍然在新鲜肉类范围之内,复合处理组的TVB-N值显著低于其他组(P<0.05),说明复合保鲜剂的保鲜效果显著优于绿球藻多糖试验组。

图8 复合保鲜液对冷鲜肉TVB-N值的影响

2.2.3 复合保鲜液对冷鲜肉pH值的影响

由图9可知,对照组的 pH值在0～10 d随冷藏时间的延长,从0 d的(5.50±0.54)上升至第10天的(6.58±0.11),相对于对照组而言,绿球藻多糖处理组和复合处理组的pH值增加缓慢,说明绿球藻多糖和复合处理组在一定程度上抑制冷鲜肉的 pH值升高。

图9 复合保鲜液对冷鲜肉pH值的影响

2.2.4 复合保鲜液对冷鲜肉汁液损失率值的影响

由图10可知,冷鲜肉在2～6 d 的汁液流失率增长较慢,6～10 d 时,汁液损失率明显低对照组(P<0.05), 6～8 d对照组的汁液流失率有显著性提高。绿球藻多糖和复合处理组的汁液流失率显著低于对照组(P<0.05),第10天对照组、绿球藻多糖和复合处理组的汁液流失率值分别为(10.60±0.08)%、(7.91±0.02)%和(7.71±0.10)%。

图10 复合保鲜液对冷鲜肉汁液流失率的影响

2.2.5 复合保鲜液对冷鲜肉感官评价的影响

此感官评价参照刘渝港等[23]的方法进行,感官评价人员在色泽、气味、组织形态、黏性等方面对各试验组进行评分(表2)。

表2 感官评价分数结果

由表2可知,复合组各方面结果为最优组,试验过程中,2 d时所有组整体差异性不显著,绿球藻多糖处理组在8 d时开始出现和对照组6 d时一样的情况,开始出现异味,黏性增加且生肉表面呈现暗红色,肉汤较浑浊,杂质多,空白组在8 d时明显异味,组织黏性大,肉汤浑浊,杂质多,10 d实验结束,复合处理组与其他单一试验组有显著性差异(P<0.05),说明复合处理组感官综合评价最好。

3 讨论与结论

绿球藻多糖具有较好的抗氧化活性,在20 mg/mL浓度下羟自由基清除能力达到98.00%;还原能力为0.64;DPPH自由基清除率达到98.69%,孙建瑞等[24]在60 mg/mL条件下,小球藻多糖清除率接近43.00%,绿球藻多糖对DPPH的清除能力强于小球藻多糖。当浓度为1 mg/mL时,超氧阴离子自由基清除率达到90.15%;在相同最高浓度1 mg/mL试验下,李旭东[25]绿球藻多糖和史瑞琴等[26]小球藻多糖口服液的超氧阴离子的清除分别是42.00%和20.00%,在相同试样浓度下,该试验研究的对超氧阴离子的清除能力优于上述2位试验结果50.00%左右,说明实验室自养绿球藻多糖的清除率与同类微藻类超氧阴离子的清除能力高很多,效果较好。当浓度为1 mg/mL时,ABTS自由基清除率达到80.10%,这与孙佳玉等[27]研究的金线莲不同植物材料提取物抗氧化能力结果一致,当组培苗提取物浓度达到4 mg/mL时,ABTS清除率为59.09%,说明绿球藻多糖ABTS自由基清除效果较好。

孙彦峰等[28]将绿球藻多糖与壳聚糖混合,制成了一种可食用的生物活性薄膜,结果表明,绿球藻多糖具有良好的自然活性成分,可以在一定程度上与壳聚糖结合,从而形成一种具有良好结构的包装薄膜。可见绿球藻多糖可望成为天然的抗氧化剂,试验结果说明,经复合保鲜液处理过的冷鲜肉第10天时菌落总数为(5.34±0.04)CFU/g,TVB-N值为(10.50±0.07) mg/100 g,pH值为(6.10±0.06),汁液损失率为(7.71±0.10)%,感官评分值(除第2天外)均显著低于对照组 (P<0.05),仍处于鲜肉标准范围,可将冷鲜肉的货架期延长至第10天。