银杏叶提取物金纳多对敌草快诱导大鼠急性肾损伤的改善作用

陈剑靖，徐美丽，何子夜，李超乾

广西医科大学第一附属医院急诊科，南宁 530021

随着百草枯逐渐退出农药市场的应用，敌草快（DQ）中毒患者日益增多。DQ 主要蓄积在患者肝脏及肾脏中。肾脏是DQ 吸收后向人体外排泄的主要器官［1］，因此DQ 中毒极易导致AKI［2］。与传统的肾损伤指标（血肌酐、尿素氮）相比，肾损伤分子-1（KIM-1）、视黄醇结合蛋白4（RBP4）是AKI 常用的检测指标［3］。目前DQ 中毒导致肾损伤的机制尚未完全阐明，有研究［2］表明，DQ 中毒肾损伤机制与核转录因子-κB（NF-κB）信号通路激活，促进炎症因子释放，加重肾损伤有关。NF-κB 是调节机体炎症反应的重要转录因子，MORAES-VIEIRA 等［4］发现RBP4 诱导的炎症反应与NF-κB 的激活有关。因此我们推测，RBP4 和NF-κB 可能参与调节DQ 中毒所致的炎症反应。肾脏损伤是DQ 中毒致死的主要原因［5］。如何缓解DQ 中毒所致的急性肾损伤，已成为目前临床治疗的一大难点。银杏叶提取物金纳多（EGB761）具抗凋亡、抗氧化、抗炎等多种功能，目前已广泛用于脑血管疾病的治疗中［6］。SENER等［7］研究表明，EGB761 能改善大鼠缺血再灌注肾损伤。我们前期研究［8］发现，EGB761 可减轻百草枯中毒小鼠的肺损伤。那么，EGB761 对DQ 中毒所致的肾损伤是否具有改善作用，目前尚未有研究报道。为此，我们观察了EGB761 对DQ 诱导的大鼠AKI 是否具有改善作用，并初步探讨其可能作用机制，旨在为临床DQ 中毒AKI 患者的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 SPF级成年健康雄性Wistar大鼠30只，体质量180～200 g，购自长沙天勤生物技术有限公司［SCXK（湘）2019-0014］。本次实验使用广西医科大学实验动物中心屏障动物实验设施，大鼠在SPF级环境饲养，经广西医科大学动物实验伦理委员会批准202104008。DQ晶体纯品（98.5 %，上海市农药研究所有限公司）；总RNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）、逆转录试剂盒及qRTPCR试剂（TaKaRa公司）。引物由南宁捷尼斯生物科技有限公司合成。RBP4 抗体（英国Abcam 公司）；KIM-1抗体（美国Novus公司）；NF-κB p65抗体（Affinity）；内参β-Actin 抗体（武汉 赛维尔公司）；酶标仪（美国Thermo公司）。病理图像分析系统（德国Leica公司）；正置荧光显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 大鼠分组及EGB761、DQ 给予方法 将30 只SPF级健康雄性Wistar大鼠分随机为敌草快 + 银杏叶提取物治疗组（DQ + EGB761组）、DQ中毒组（DQ组）及对照组（NS组），每组各10只。将DQ标准品（纯度98.5 %）配制成25 mg/mL DQ 溶液，DQ 组和DQ +EGB761组予154 mg/kg DQ溶液灌胃（设为第1天），NS组予等剂量生理盐水灌胃。DQ灌胃后半小时DQ+ EGB761组予10 mL/kg EGB761腹腔注射（1次/天，时间间隔24 h，连续3次），DQ组与NS组腹腔注射等剂量的生理盐水（1次/天，时间间隔24 h，连续3次）。NS组大鼠精神、活动、饮食、大小便正常，毛发水亮；DQ 灌胃后DQ 组染毒后逐渐出现精神萎靡、毛发竖起、易激惹、进食减少、拉稀便等中毒症状。DQ +EGB761组与DQ组相比，以上中毒症状均减轻。第4天时用二氧化碳窒息法麻醉各组大鼠，将其仰卧位置于解剖台上并固定好四肢，剔除胸腹部皮毛，消毒，用手术刀沿腹白线切开，从剑突到下腹部，充分暴露下腹部，取一半肾脏组织用生理盐水清洗两次，用4 %多聚甲醛溶液浸泡固定24 h，一部分肾脏组织切片后用于HE染色观察各组大鼠肾组织病理变化。一部分肾脏组织-80 ℃冰箱保存以备后续研究。

1.3 各组大鼠AKI程度观察

1.3.1 各组大鼠肾组织病理变化观察 取各组大鼠肾组织，HE 染色后镜下观察肾组织病理变化，对各组大鼠肾组织进行病理评分，评分标准为：正常肾小管计0分；轻度肾小管损伤，影响视野＜25 计1分；中度肾小管损伤，影响视野25 %～50 %计2分；重度肾小管损伤，影响视野＞50 %计3分。

1.3.2 各组大鼠肾组织肾损伤指标KIM-1mRNA及蛋白检测 取各组大鼠肾组织，分别采用PCR和WESTERN Blotting 法检测各组大鼠肾组织KIM-1mRNA 及蛋白。PCR：使用离心柱法提取各组肾组织中KIM-1 总RNA，采用逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，进行 Real time PCR 扩增检测大鼠肾组织中的KIM-1 mRNA 的相对表达量。KIM-1 上游引物：5’-CATTTCCACTCCACTTCTGTCTTG-3’；KIM-1 下游引物：5’-CTCCTTTCTTTCCTCTTTCGTTTCT-3’。β-Actin 上游引物：5’-AGATCAAGATCATTGCTCCTCCTG-3’；β -Actin 下游引物：5’-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC-3’。以β-Actin 作为内参，以2-ΔΔCt代表目的mRNA的相对表达量。重复测算3 次，取平均值。WESTERN Blotting 法：取大鼠肾组织，BCA法检测蛋白浓度，用Odyssey system 扫膜。应用Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参β-Actin蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白表达量。重复测算3次，取平均值。

1.4 各组大鼠肾组织RBP4、NF-κB mRNA 和蛋白及其下游因子TNF-α、IL-1β 的mRNA 检测 取各组大鼠肾组织，采用PCR 法检测RBP4、NF-κB、TNF-α和IL-1β 的mRNA，WESTERN Blotting 法检测RBP4和NF-κB 蛋白。 PCR 实验具体操作步骤同“1.3.2”。RBP4 上游引物：5’-GTGAGGCAGCGACAGGAGGA-3’；RBP4 下游引物：5’-GGGGAGGTGGGGAAACTAAACT-3’；NF-κ B 上游引物：5’-GAAGTTAGGTCTGGGGATATTGA-3’；NF-κB 下游引物：5’-ATGTGCTGTCTTGTGGAGGAG-3’；TNF- α 上游引物：5’-CTGGCGTGTTCATCCGT TCT-3’；TNF-α 下游引物：5’-TCAGCGTCTCGTGTGTTTCTG-3’；IL-1β 上游引物：5’-CTATGTCTTGCCCGTGGAGC-3’；IL-1β 下游引物：5’-AGGTCGTCATCATCCCACGA-3’。WESTERN Blotting实验具体操作步骤同“1.3.2”。按照抗体说明书用一抗稀释液稀释一抗，RBP4、NF-κ B 的稀释比例分别为1∶2 000、1∶1 000。实验均重复测算3次，取平均值。

1.5 统计学方法 采用SPSS 23.0 统计软件进行数据处理。使用GraphPad Prim 8.0.2 软件绘图，计量资料通过Shapiro-Wilk 进行正态性检验，符合正态分布的数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾组织损伤情况

2.1.1 各组大鼠肾组织病理变化及病理评分 光镜下NS 组大鼠肾组织结构清晰，肾小管结构正常，未见水肿及充血；DQ 组大鼠肾小管上皮细胞肿胀，管腔变窄，部分肾小管上皮细胞空泡变性、坏死，大量炎细胞浸润。DQ + EGB761组与DQ组相比，肾小管上皮细胞肿胀程度及炎细胞浸润程度明显减轻。DQ + EGB761 组、DQ 组及NS 组肾组织病理评分分别为（1.5 ± 0.52）、（2.25 ± 0.75）、0 分。与NS 组比较，DQ 组大鼠肾组织损伤情况明显加重（P＜0.05）；与DQ组比较，DQ + EGB761组大鼠肾组织肾损伤情况明显减轻（P＜0.05）。

2.1.2 各组大鼠肾组织KIM-1mRNA 及蛋白相对表达量比较 DQ + EGB761组、DQ组、NS组大鼠 肾组织KIM-1mRNA 相对表达量分别为2.10 ± 1.14、5.01 ± 1.33、1.00 ± 0.07，KIM-1蛋白相对表达量分别为0.29 ± 0.14、0.59 ± 0.03、0.17 ± 0.1。与NS组比较，DQ 组大鼠肾组织KIM-1 mRNA 和蛋白相对表达量高（P＜0.05）；与DQ组比较，DQ + EGB761组大鼠肾组织KIM-1 mRNA和蛋白相对表达量低（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠肾组织RBP4、NF-κB 、TNF-α、IL-1β的 mRNA及蛋白相对表达量比较

2.2.1 各组大鼠肾组织RBP4 mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 相对表达量比较 各组大鼠大鼠肾组织RBP4 mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 相对表达量见表1。与NS 组比较，DQ 组大鼠肾组织RBP4 mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 相对表达量高（P均＜0.05）；与DQ 组比较，DQ + EGB761 组大鼠肾组织RBP4 mRNA、NF- κB mRNA、TNF- α mRNA、IL-1β mRNA相对表达量低（P均＜0.05）。

表1 各组大鼠肾组织RBP4 mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA、IL-1β mRNA相对表达量（± s）

表1 各组大鼠肾组织RBP4 mRNA、NF-κB mRNA、TNF-α mRNA、IL-1β mRNA相对表达量（± s）

组别DQ + EGB761组DQ组NS组RBP4 mRNA 1.40 ± 0.09 2.47 ± 0.61 1.02 ± 0.09 NF-κB mRNA 1.43 ± 0.47 2.23 ± 0.13 1.02 ± 0.05 TNF-α mRNA 1.54 ± 0.12 2.40 ± 0.21 1.00 ± 0.04 IL-1β mRNA 1.26 ± 0.10 1.99 ± 0.14 1.00 ± 0.05

2.2.2 各组大鼠肾组织RBP4、NF-κB 蛋白相对表达量比较 各组大鼠肾组织RBP4、NF-κB 蛋白相对表达量见表2。与NS 组比较，DQ 组大鼠肾组织RBP4、NF-κB 蛋白相对表达量高（P均＜0.05），与DQ 组比较，DQ + EGB761 组大鼠肾组织RBP4、NF-κB蛋白相对表达量低（P均＜0.05）。

表2 各组大鼠肾组织RBP4、NF-κB蛋白相对表达量（± s）

表2 各组大鼠肾组织RBP4、NF-κB蛋白相对表达量（± s）

组别DQ + EGB761组DQ组NS组RBP4 1.22 ± 0.17 1.6 ± 0.19 0.42 ± 0.09 NF-κB 0.54 ± 0.10 0.75 ± 0.05 0.44 ± 0.11

3 讨论

DQ中毒目前尚未有特效解毒剂，其发病率和死亡率都很高。肾脏损伤是DQ 中毒致死的主要原因。如何缓解DQ 中毒所致的肾损伤，成为临床治疗的一大难点，寻找可以缓解DQ 中毒AKI 的药物十分有必要。

DQ 中毒可导致多个器官损害，其中肾脏是DQ中毒损害的主要靶器官［1］。贾俊娥等［9］实验发现DQ染毒24 h 后，组织中DQ 浓度顺序为：肾脏＞脾脏＞肝脏＞心脏＞肠＞肺脏。有研究［2］表明，DQ 中毒患者发生AKI 的可能性高达81%，AKI 主要表现为肾小管损伤。本研究也发现，DQ 中毒组大鼠出现了少尿、无尿甚至血尿等肾损伤表现，肾组织HE 染色光镜下观察发现DQ 中毒组大鼠肾小管上皮细胞出现明显水肿，管腔变窄，部分肾小管上皮细胞出现空泡变性、坏死等情况，且有大量炎细胞浸润。KIM-1 在正常肾组织中几乎不表达，但当肾组织发生毒性损害时，肾近曲小管上皮细胞会释放大量的KIM-1，KIM-1的表达量显著增高［10］。有研究［3］表明，KIM-1可作为肾损伤24 h 的一个早期AKI 生物学标志物。超过99%的RBP4会被近端肾小管重新吸收，RBP4可作为肾小管损伤的早期敏感指标。本研究也发现，与NS组相比，DQ中毒组大鼠KIM-1和RBP4的表达水平均显著升高。本研究结果表明，DQ中毒可导致明显的肾损伤，且主要以肾小管损伤为主，经EGB761 干预后，DQ + EGB761组肾小管上皮细胞水肿程度及炎症浸润较DQ 组相比均明显减轻。经EGB761 干预后，DQ + EGB761组KIM-1和RBP4的表达水平较DQ组相比显著降低。表明EGB761可以减轻DQ中毒所诱导的大鼠急性肾损伤。

DQ中毒导致肾损伤的机制尚未完全阐明，可能与氧化应激、炎症反应，细胞凋亡等有关［11］。DQ 进入细胞后，在细胞色素P450 还原酶的催化下，将DQ2+还原成DQ+自由基。DQ+很不稳定，在氧气存在的条件下形成超氧阴离子自由基（·O2-），而DQ+失去电子后转变成DQ2+。DQ2+在还原酶细胞色素P450 和辅酶NADPH 的双重作用下，继续进行氧化还原反应，再次还原成DQ+自由基，DQ+不断地与氧结合，产生超氧阴离子自由基（·O2-），循环往复周而复始形成持续的氧化还原循环［12］。这种持续的氧化还原循环，会导致大量活性氧（Reactive oxygen species， ROS）的产生，ROS 与所有细胞大分子，尤其是多不饱和脂肪酸相互作用，这是膜结构的主要组成部分，能轻易通过脂质过氧化作用被ROS 附着，造成细胞死亡［13］，进一步激活NF-κB 等炎症信号通路，造成细胞损伤等［14］。岑祥莹等［2］研究发现DQ中毒肾损伤机制与白介素-17 含量增加和NF-κB信号通路激活有关，通过抑制白介素-17 的表达，可抑制NF-κB 信号通路激活，从而减轻DQ 中毒肾损伤。

NF-κB 是一种转录因子，可参与调节机体的免疫反应、炎症和凋亡等［5］，也是DQ 中毒氧化应激反应的重要转录因子。有研究［15］表明，正常大鼠的肾组织中NF-κB 表达较低，而急性DQ 中毒大鼠肾组织中NF-κB 表达较高。有研究［6］发现RBP4 诱导的炎症反应，主要由Toll 样受体2/4（TLR2/4）的激活和巨噬细胞的促炎细胞因子分泌介导，激活NF-κB 信号通路，并引起其下游因子TNF-α 和IL-1β的表达升高。本研究结果发现与NS 组相比，DQ 组大鼠RBP4 和NF-κB 的mRNA 和蛋白表达水平均明显升高。与NS组相比，DQ组大鼠TNF-α和IL-1β的mRNA 表达水平均显著增高。结果表明，DQ 中毒后可能通过激活NF-κB/RBP4 信号通路，促进其下游炎症因子TNF-α和IL-1β的表达。

LI 等［16］研究表明，EGB761 能通过抑制促炎细胞因子和JAK-STAT 信号传导，减轻脑死亡引起的肾损伤。FANG 等［17］发现EGB 治疗可以有效缓解缺血性结肠炎症状，加快粘膜愈合。可能通过清除氧化自由基和下调炎症介质（TNF-α 和IL-6 等），改善缺血性结肠炎。本研究中：经EGB761 干预后，DQ +EGB761 组大鼠RBP4 和NF-κB 的mRNA 和蛋白表达水平均明显低于DQ 组，DQ + EGB761 组大鼠TNF-α 和IL-1β 的mRNA 表达水平均明显低于DQ组。表明EGB761 能显著降低RBP4、NF-κB、TNF-α和IL-1β 的表达水平，其可能通过抑制NF-κB/RBP4信号通路，从而抑制其下游因子TNF-α 和IL-1β 的表达，减轻DQ中毒后导致的炎症反应。

综上所述，EGB761可以有效改善DQ中毒AKI，其可能通过抑制NF-κB/RBP4 信号通路，发挥肾脏保护作用。本研究还存在不足之处，在本研究中我们只验证了RBP4、NF-κB 及其下游因子的改变，尚未用相关激动剂和抑制剂对NF-κB/RBP4信号通路进行双重验证，有待后续实验深入研究。