菌种保藏管法和冷冻真空干燥保藏法对金黄色葡萄球菌抗力的影响

裴正胜，张宁，邢国庆，王淏

（1.南召县人民医院 检验科，河南 南召 474650；2.南阳市第二人民医院 检验科，河南 南阳 473000）

金黄色葡萄球菌作为一种重要病原菌，在生活、科研及医学中都至关重要，而菌种的管理及保藏直接影响微生物资源的应用［1］。科学、可行、优质的保藏方式可避免微生物在传代、保藏过程中出现死亡、活力下降等情况影响进一步研究［2］。目前对于金黄色葡萄球菌保藏方法有菌种保藏管法及冷冻真空干燥保藏法，两种方法各有优劣且应用广泛，但是对于两种保藏方式对金黄色葡萄球菌菌落形态及抗力影响有待进一步探讨。菌种保藏管法操作简便且利用商品化瓷珠进行保藏，在实用性方面具有独特优势，冷冻真空干燥保藏法利用冷冻及真空干燥使微生物在缺氧、低温条件下保持较低生命活动能力以达到长期保藏效果［3］。本研究就此进一步探讨二者对金黄色葡萄球菌抗力影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

全部金黄色葡萄球菌菌株（BNCC353548）均由北纳生物-北京北纳创联生物技术研究院提供且本研究采用营养琼脂培养基进行实验。84 消毒液（中威合一（山东）医疗科技有限公司）为含氯消毒剂并采用实验室去离子水配置为100 mg/L 有效氯溶液。

1.2 方法

1.2.1 菌种保藏管法 由专业人员将金黄色葡萄球菌进行培养纯化，随后将纯化后的球菌沾染于灭菌瓷珠上且封装于适配保藏管中，最后将保藏管置于-80℃冰箱进行保藏，共保藏四支，保藏时间分别为0.5 年、1 年、2 年、3 年。

1.2.2 冷冻真空干燥保藏法 首先用2%盐酸处理安瓿管，然后由专业人员将金黄色葡萄球菌活化并加入无菌脱脂牛奶制备混悬液，依据分装、冷冻、干燥操作流程进行操作，最后封管进行保藏，共保藏四管，保藏时间分别为0.5 年、1 年、2 年、3 年。

1.2.3 试验菌悬液 将4 支菌种保藏管法保藏的瓷珠分别取出并加入适量营养肉汤进行培养（37℃,24 h），然后采用接种环（15 μL）将球菌（一环）依次接种于营养琼脂平板及营养琼脂斜面（需单个典型菌落）进行培养（37℃,24 h），最后用磷酸盐缓冲液冲洗新鲜斜面培养物并制备试验菌悬液（5×108cfu/mL）。4 管冷冻真空干燥保藏法保藏的冻干粉分别采用1 mL 磷酸缓冲液溶解后加入适量营养肉汤进行培养（37℃,24 h），按上述方法制备5×108cfu/mL 试验菌悬液。

1.2.4 中和剂鉴定试验 设置7 个试验组并依据中和剂鉴定试验进行操作，长菌结果以1 组少于2 组，2 组少于3～5 组（误差率低于10%）且6 组不长菌为准，最终重复三次结果一致说明中和剂适宜。

1.2.5 杀菌试验 将500 μL 小牛血清与500 μL 试验菌悬液在20℃水浴条件下进行混合，然后加入5 mL 消毒液并振荡混匀，待混合物反应5 min 后用移液枪取500 μL 加入中和剂（5 mL）试管并振荡混匀，充分反应10 min 后取样稀释并依次接种于灭菌皿中进行培养（37℃,48 h，营养琼脂培养基）。将试验重复5 次且均进行活菌计数与杀菌率计算。

1.3 统计学方法

全部数据采用SPSS 25.0 软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验；计数资料以百分率（%）表示，采用χ2检验，组间比较采用Kruskal-Wallis 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冷冻真空干燥保藏法杀菌试验结果

冷冻真空干燥保藏0.5 年、1 年、2 年、3 年后消毒液对金黄色葡萄球菌杀菌率依次为99.031%、99.038%、99.052%、99.060% 且差异无统计学意义（H=0.659,P=0.703），见表1。

表1 冷冻真空干燥保藏法杀菌试验结果

2.2 菌种保藏管法杀菌试验结果

菌种保藏管法保藏0.5 年、1 年、2 年、3 年后消毒液对金黄色葡萄球菌杀菌率依次为99.075%、99.195%、99.489%、99.971% 且差异有统计学意义（H=11.465,P=0.003），见表2。

表2 菌种保藏管法杀菌试验结果

2.3 两种方法对存活率影响比较

保藏0.5 年时，两种保藏方法对金黄色葡萄球菌存活率影响比较差异无统计学意义（P＞0.05），保藏1 年、2 年、3 年后，冷冻真空干燥保藏法保藏的金黄色葡萄球菌存活率明显高于菌种保藏管法，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 两种方法对存活率影响比较（,%）

表3 两种方法对存活率影响比较（,%）

3 讨论

金黄色葡萄球菌菌种保藏对于科研、食品、工厂生产等均有重要意义且优质的保藏方式可有效提高菌种存活率，有利于后续进一步进行实验操作［4］。保藏方法基本原则是利用各种方法使菌种生命活力降到最低从而长时间储存以备下次使用，其中延长保藏时间有多种方式（无氧、无营养、干燥、低温等）［5］。其中冷冻真空干燥保藏法及菌种保藏管法是近些年对于菌种保藏使用率较高的方法，二者均应用广泛且短时间保藏效果明显，但是仍未有研究分析二者对于金黄色葡萄球菌保藏的优劣及对菌种抗力的影响，本次研究中采用84 消毒液对不同保藏时间、保藏方法下金黄色葡萄球菌的存活情况进行分析，杀菌率越高表示金黄色葡萄球菌抗力越低［6］，具体研究结果及分析如下。

冷冻真空干燥保藏0.5 年、1 年、2 年、3 年后消毒液对金黄色葡萄球菌杀菌率依次为99.031%、99.038%、99.052%、99.060% 且差异无统计学意义（P＞0.05）。说明冷冻真空干燥保藏法无论是短期还是长期保藏金黄色葡萄球菌，对于球菌杀菌效果影响较小［7］。分析原因冷冻真空干燥保藏法同时综合了冷冻、干燥、无氧多种保藏条件，协同发挥缺氧、低温、低营养三方面保藏作用［8］，将微生物的代谢及生命活力将至最低以延长保藏时间［9］。冷冻真空干燥保藏法长时间保藏后对于微生物内部代谢机制、途径、正常结构的影响较小，对细胞膜通透性、蛋白质合成机制、核酸复制与转录机制影响均较小，因此金黄色葡萄球菌“休眠”状态结束后抗力改变较小。

菌种保藏管法保藏0.5 年、1 年、2 年、3 年后消毒液对金黄色葡萄球菌杀菌率依次为99.075%、99.195%、99.489%、99.971% 且差异有统计学意义（P＜0.05）。说明菌种保藏管法保藏金黄色葡萄球菌，对球菌杀菌效果影响较大，其中三年保藏后消毒液杀菌率明显升高，因此此法长期保藏可导致球菌抗力下降。分析原因菌种保藏管法利用冷冻、瓷珠二者优势对金黄色葡萄球菌进行保藏，短期保藏对微生物代谢影响较小，但是长时间保藏后瓷珠上的微孔对菌种的干燥及吸附作用有限，随着时间延长，保藏效果呈下降趋势［10］。菌种保藏管法保藏过程中有空气存在，距离严格无氧条件较远，因此长时间保藏后容易影响微生物代谢模式，改变蛋白合成情况，再次接种试验后对消毒液抵抗力下降，因此3 年保藏的杀菌率较高。

保藏0.5 年时，两种保藏方法对金黄色葡萄球菌存活率影响比较差异无统计学意义（P＞0.05），保藏1 年、2 年、3 年后，冷冻真空干燥保藏法保藏的金黄色葡萄球菌存活率明显高于菌种保藏管法（P＜0.05）。说明0.5 年保藏时，两组方法对金黄色葡萄球菌存活情况影响较小，而长期保藏后冷冻真空干燥保藏法金黄色葡萄球菌存活情况更好。分析原因相比于菌种保藏管法（吸附、低温），冷冻真空干燥保藏法在保藏方式（低温、真空、低营养）上更具有优势，保藏过程中将金黄色葡萄球菌活力降至更低状态且对微生物复苏后正常代谢影响较小，因此试验过程中平均菌落存活情况更好。本研究结果与王凯［11］对冷冻干燥法研究结果一致，冷冻干燥法保藏金黄色葡萄球菌效果较好且对菌株生化结构影响较小。

综上所述，相比于菌种保藏管法，利用冷冻真空干燥保藏法长时间保存的金黄色葡萄球菌对消毒液的抗力影响更小且存活率更高。菌种保藏管法操作简便，冷冻真空干燥保藏法操作复杂，但是经济实惠。实验室保藏金黄色葡萄球菌应根据具体条件进行选择。