液体活检在原发性肝癌诊疗中的研究进展

胡灵溪,安薪宇(综述),王荣琦(审校)

(河北医科大学第三医院中西医结合肝病科,河北 石家庄 050051)

原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)是我国第5位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因,该病起病隐匿,手术切除率低,复发和转移率高,五年净生存率仅为14.1%[1],发展敏感度、特异度高,精准、无创、简便的肝癌早期筛查技术是临床亟待解决的重大问题。液体活检是指对实体肿瘤释放到血液、尿液和唾液等体液中的肿瘤成分进行分析的技术,可实时监测机体肿瘤发生的分子改变,展现出患者癌症恶性程度的完整分子图谱,减少肿瘤播散的风险,未来可能成为替代性检测手段。本文就当前液体活检不同检测物在诊断预后方面的应用价值及优缺点进行综述,以期为原发性肝癌的诊疗提供帮助。

1 循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)

CTCs是指在原发性或转移性肿瘤形成或发展过程中,因自发脱落或诊疗操作由肿瘤灶进入外周循环的肿瘤细胞,常被比作肿瘤的“种子”。

以往循环系统中的CTCs主要用来预测肿瘤的转移,近年研究证实,早期癌症患者外周血中同样存在CTCs,因此CTCs也可用于早期诊断,尤其在诊断甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)阴性肝癌中有很高的准确性[2],与TNM分期、BCLC分期、血管侵犯、门静脉癌栓、癌灶大小、癌灶数量、血清AFP水平显著相关[3-4]。一项前瞻性研究发现,112例术前CTCs检出率高的已接受癌灶切除术的肝癌患者中有101例(90.18%)呈CTCs阳性,12例乙型肝炎病毒(hepatitis B,HBV)患者中2例存在少量CTCs,在随访的5个月内均经CT/MRI检测到小肝癌[5],说明对于肝癌高风险的患者,CTCs异常可能先于影像学改变,并可能成为在极早期检测出肝癌的重要手段。Cui等[6]对CTCs在肝癌的诊断价值荟萃分析显示,CTCs具有高度的特异度(95%),中等的敏感度(60%),具有出色的诊断价值(AUC=0.910)。CTCs除可用于肝癌早期诊断外,还可作为判断预后的指标,用来评估治疗效果[7],持续高CTCs负荷的患者在手术后显示出肿瘤复发的倾向[8],治疗前后CTCs数量的变化比单独治疗前的计数更能准确识别出肝癌复发与否,其在预测肝癌治疗后复发的效能可能优于癌症分期等传统指标。

CTCs在外周循环系统中丰度低,近年来,分子检测技术的飞速发展使得分离和检测外周血样本中的CTCs成为可能,CTCs具有完整的细胞形态和功能,能够进行细胞培养和进一步的生物学分析,可为研究者提供原发肿瘤的病理特征以及完整的肿瘤学信息[9],另外,CTCs的深度测序可识别突变,其中一些突变与在原发肿瘤样本中检测到的突变不同,与肝组织活检相比,CTCs可提供更全面的信息[10]。所以,CTCs是目前具有发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段,具有广阔的应用前景。

2 循环游离DNA和循环肿瘤DNA(circulating free DNA and circulating tumor DNA,cfDNA and ctDNA)

cfDNA是指外周循环中存在于细胞外的部分降解的内源性DNA[11],大多数来源于骨髓和肝脏,也可来源于肿瘤细胞的释放。cfDNA可代表肿瘤负荷并反映肝癌的遗传特征,cfDNA水平越高,疾病越严重。ctDNA是指在肿瘤增殖过程中,凋亡或坏死的肿瘤细胞释放或肿瘤细胞主动分泌的DNA片段,属于cfDNA的一小部分,因其半衰期较短,可实时评估肿瘤状态,使其成为早期诊断肝癌、评估治疗效果并及时调整治疗方案、监测肿瘤复发的理想选择[12]。在肝癌患者中,cfDNA遗传和表观遗传学改变与肿瘤的发生、发展及治疗耐受有关,在肝癌各分期中都是可量化的,可通过深度测序检测突变、拷贝数变异和甲基化特征等多种信息的变化,来区分是否发生癌变[11]。

2.1cfDNA突变 Nault等[12]通过全外显子组测序对801例肝癌组织进行基因组分析发现,最常发生突变的基因依次是TERT(58.1%)、CTNNB1(30.7%)、TP53(18.7%)、ARID1A(13%)、白蛋白(11.4%)、APOB(9.4%)和AXIN1(9.2%)。单一的cfDNA突变作为肝癌的诊断标志物并不具有足够高的敏感度,多个突变位点相结合可提高检出效能,故cfDNA突变图谱已被研发用于肝癌诊断及预后评价。Cai等[13]等通过综合所有体细胞变异的动态变化将ctDNA突变谱图进行整合,高度准确地评估患者的肿瘤负荷,平均比影像发现肿瘤早4.6个月,比AFP等血清学蛋白标志物具有更好的诊断效能,并可提前检测出微小残留病变,预测患者的无复发生存期和总生存期。现有更多研究表明,早期cfDNA入血丰度低,联合蛋白标志物可提高其诊断效能。Qu等[14]提出了联合蛋白标志物与cfDNA突变的肝癌筛查手段“HCC screen”,其在135例AFP或 US异常的HBsAg阳性患者中表现出85%的敏感度和93%的特异度,更为重要的是,331例AFP及US阴性患者中同样表现出良好的诊断效能,敏感度和特异度高达100%和94%。Cohen等[15]将8种血清学标志物与16种cfDNA肿瘤相关基因相结合,建立的CancerSeek诊断模型已证明在早期肝癌的诊断中具有98%的敏感度和大于99%的特异度。除此之外,cfDNA突变可用于鉴定肿瘤基因图谱以进行个体化治疗。Ikeda等[16]通过ctDNA基因测序发现PTEN失活和MET激活的晚期肝癌患者行西罗莫司和卡博替尼治疗预后更佳,ARID1A和BRCA2突变在卡培他滨治疗的肝癌患者中随全身治疗明显减少,并在疾病进展后患者出现TP53突变,因此,肝癌患者可根据突变基因制定治疗方案,并通过连续分析ctDNA基因组图谱监测患者的疾病进展并及时调整治疗方案。

2.2cfDNA甲基化 cfDNA甲基化是基因表达的表观遗传学改变的核心机制,特定基因甲基化可反映相应肿瘤组织中DNA甲基化改变,因此基因的甲基化特征可用于识别cfDNA的组织来源[17]。局灶性高甲基化变化可导致肿瘤关键抑制基因失活,控制细胞周期和生长调节区域失调,降低对治疗的反应。DNA甲基化的异常表观遗传改变通常发生在肿瘤形成或发展之前,可用于诊断早期肿瘤或识别高危人群。SEPT9是细胞分裂的关键调节剂,作为肿瘤抑制因子,广泛存在于机体各个组织器官中[18]。一项法国研究分析98例肝癌患者和191例健康对照者中SEPT9的甲基化水平,发现SEPT9甲基化对肝癌的诊断准确率很高,AUC达0.940,但其对BCLCA期肝癌的敏感度仅为64%[19]。RASSF1A是癌症进展的抑癌基因,在原发性肝癌中,RASSF1A通过启动子高甲基化而失活,敏感度为66.7～100%。Wen等[20]检测cfDNA中CpG岛高甲基化的基因组(RGS10、ST8SIA6、RUNX2和VIM),发现该基因组在36例肝癌患者,17例肝硬化患者和38名健康对照者中的敏感度为94%,特异度为89%,并且5例AFP阴性的肝癌患者均被确诊。在一项1 933例患者参与的大型研究中,Xu等[21]构建出BMPR1A等10个甲基化标志物的诊断预测模型,该模型在715例肝癌患者和560名健康对照者的训练集中对肝癌的敏感度和特异度高达85.7%和94.3%,在383例肝癌患者和275例健康对照的验证集中敏感度和特异度达83.3%和90.5%。另外,Xu等建立区分肝病和肝癌模型的综合诊断评分“CD-SCORE”,有效地将肝癌患者与病毒性肝炎患者、脂肪肝患者以及健康对照者区分开来。由此可见,cfDNA甲基化可能是液体活检中诊断早期肝癌更为有效的诊断标志物。

2.3cfDNA羟甲基 cfDNA羟甲基化是近年来备受关注的表观遗传学改变。5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC)是通过11易位酶氧化5-甲基胞嘧啶而产生的启动子。Cai等[22]开发并验证了一种基于5-hmC的基因诊断模型“WD-SCORE”,该模型在2554例受试者中鉴别巴塞罗那肝癌分期0期和非肝癌患者(AUC=0.871)、癌灶直径≤ 2.0 cm和非肝癌患者(AUC=0.851)、早期肝癌和具有HBV或肝硬化病史的高危人群(AUC=0.846)中均表现出优越的诊断效能,且明显优于AFP。因此,5-hmC检测技术作为一种非侵入性检查手段,可以帮助HBV或肝硬化病史的高危人群及早发现肝癌。

M2P-HCC(methylation,mutation&protein,M2P)模型是一种基于cfDNA的液体活检技术,通过检测特异性靶基因甲基化、高发性体细胞点突变、相关性筛查蛋白三个层面的多维度指标,进行人工智能建模,建立肝癌早筛预测模型,如报告显示阳性或预警,通过进一步影像检查,可实现肝癌早发现、早诊断。一项基于1 615例乙型肝炎表面抗原阳性患者的多中心前瞻性研究数据显示,M2P-HCC模型用于肝癌筛查的敏感度和特异度分别为88%、93%,明显优于AFP联合超声检查[1],对肝癌高危人群,特别是肝硬化患者可做肝癌筛查和监测的补充。目前该技术已应用于临床。

3 外泌体(exosomes)

外泌体是正常细胞或肿瘤细胞释放的直径为50～150 nm的小膜状囊泡,其内含有信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)、微小核糖核酸(microRNA、miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)等多种核酸片段及蛋白质等,广泛分布于血液、腹水、尿液和唾液等体液中[11]。

3.1miRNA miRNA是内源性非蛋白质编码RNA家族的成员,大小为20～22个核苷酸。外泌体中miRNA-224、miRNA-93、miRNA-92b、miR-106a等在肝细胞癌患者中表达上调,miRNA-125b、miRNA-638、miRNA-122等表达下调,特定miRNA的差异表达可作为肿瘤潜在的标志物,用于肿瘤早期诊断。Cho等[23]研究发现,肝癌患者特别是癌灶直径≤ 2.0 cm的患者,血清miR-10b-5p表达显著上调,但HBV或肝硬化患者血清中未发现其表达增加,表明miR-10b-5p表达水平可用于区分早期肝癌与肝癌高风险患者,这可能是由于大部分miR-10b-5p来自肝癌细胞,其表达受肝脏炎症和纤维化的影响小。Wang等[24]研究发现早期和晚期肝癌患者的miR-122、miR-148、miR-1246表达水平均显著高于肝硬化和健康对照者(P<0.001),区分早期肝癌和肝硬化时,miR-148a明显优于AFP(P<0.05),miR-122、miR-148a和AFP联合诊断的敏感度和特异度分别达87.0%和90.0%。血清miRNA除可用于早期诊断外,还与肿瘤负荷、临床预后密切相关。miR-125b是一种肿瘤抑制因子,可直接调节SMAD2/4、Sirtuin7、SUV39H1、LIN28B和PIGF,抑制肝癌的生长、迁移和侵袭,在Liu等[25]的随机对照研究中,肝癌患者血清中miR-125b的表达降低,且与肝癌患者的癌灶数量、分化程度和TNM分期呈负相关,与水平较高的患者相比,miR-125b减少的患者复发时间(P<0.01)和总生存期(P<0.01)均缩短,可用于判断患者预后。Nakano等[26]发现肝移植前miR-92b水平具有预测移植后肝癌复发的临床价值,移植前AFP和miR-92b联合检测可进一步提高移植后患者肝癌复发的预测准确性(AUC=0.760)。外泌体可保护其内部miRNA免受降解,从而稳定存在于循环中,多研究表示,外泌体miRNA是比血清miRNA更有效的诊断生物学标志物[24],但外泌体的准确分离仍然存在一定的困难,限制了其在临床中的广泛应用。

3.2lncRNA lncRNA是长度>200个核苷酸的非蛋白质编码转录物,是非编码RNA中最广泛的类别。有研究报道lncRNA在恶性胶质瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、多发性骨髓瘤等中呈异常表达,可能会成为新的肿瘤标志物,用于患者筛查诊断、治疗疗效和预后评估。Zeng等[27]荟萃分析发现,lncRNA诊断肝癌的敏感度、特异度可达85%、76%(AUC=0.880)。Xu等[28]利用血清外泌体中hnRNPH1 mRNA鉴别肝癌和HBV患者,其敏感度和特异度分别为85.2%和76.5%(AUC=0.670),与血清AFP联合检测诊断效能更高;另外,进一步研究发现,肝癌患者外泌体hnRNPH1 mRNA水平与Child-Pugh评分、门静脉癌栓、淋巴结转移、TNM分期和总生存期相关(P<0.05)。Wu 等[29]从155例接受肝移植治疗的肝癌患者中收集血液和肝癌组织样本,发现lncRNA HOTTIP 在肝癌组织中高表达,是肝移植后肝癌复发的独立危险因素,并与总生存期缩短相关。由此可见,血清外泌体lncRNA水平在肝癌的早期诊断及预后评估中均具有重要的预测价值。

3.3蛋白质 Vesiclepedia数据库显示,外泌体中的蛋白质数量约为1 800个,根据外泌体中蛋白质的位置不同分为货运蛋白和膜蛋白,在不同肿瘤发展过程中,外泌体中的货运蛋白组成不同[30],He等[31]在肝癌细胞系衍生的外泌体中发现213种特有的蛋白质,Arbelaiz等[32]分析肝癌组和健康对照组中外泌体蛋白质的表达,发现肝癌患者外泌体中半乳糖凝集素3结合蛋白(galectin-3-binding protein,G3BP)和聚合免疫球蛋白受体(polymeric immunoglobulin receptor,PIGR)显著升高,这两种蛋白对肝癌的早期诊断优于AFP,均是促进肝癌进展、肿瘤细胞转化、侵袭和增殖的致癌蛋白,也被认为是HCC不良预后的生物标志物。铁调素是人体铁代谢的重要调节剂,铁过量被认为是驱动肝癌发生发展的重要因素之一,肝癌患者血清外泌体铁调素mRNA水平明显高于健康人[33],可作为肝癌风险的诊断标志物。

另外,外泌体具有保护内部RNA及蛋白质、低免疫原性、可通过血管内皮组织等多种特性,故可用作药物载体。Lou等[34]报道,转染miR-122的间充质肝细胞可将miR-122包裹于分泌的外泌体,介导间充质肝细胞与肝癌细胞之间的miR-122通信,从而改变miR-122靶基因表达使肝癌细胞对化疗药物更敏感,显著提高药物的抗肿瘤效果。Tian等[35]将小鼠未成熟树突状细胞改造为外泌体膜蛋白,显示出高效的靶向性和药物呈递功能,静脉注射靶向外泌体可将药物特异性递送至肿瘤组织,从而抑制肿瘤生长而没有明显毒性。因此,外泌体有望成为肝癌靶向治疗的药物载体。

4 展望

液体活检包含潜在肿瘤组织释放的所有肿瘤成分,可获取先于影像学改变的分子变化,并且不受特定穿刺活检的限制,比AFP等血清学标志物更好地预测肿瘤发生或进展,可在肝癌早期诊断、疗效监测、预后判断、靶向药物治疗等临床应用方面持续发挥巨大作用。因此,虽然液体活检基因组具有不稳定性,检测成本高,目前亦缺乏大规模的验证性临床研究,但随着新技术的不断研发,将加快肝癌分子诊断标志物的筛选和鉴定,为肿瘤的精准诊疗开辟新路径。