促血管和血管拟态生成因子VEGFA、MMP-14在肺腺癌中的表达及临床意义

李 辉,黄俊峰,周 静,周廷栋,陈礼文

根据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的全球癌症负担数据显示,2020年中国肺癌新发病例82万例,占新发癌症的17.9%,肺癌死亡71万例,占癌症死亡总数的23.8%,均远远高于其他癌症占比,其中肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)为最常见的病理类型[1]。LUAD的高侵袭和转移是导致预后不良的主要原因,严重危害人类健康[2]。

肿瘤的生长、侵袭、转移与经典血管形成(毛细血管芽生方式)和血管拟态形成有密切联系[3-4]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGFA)和基质金属蛋白酶-14(matrix metalloproteinase-14,MMP-14)分别参与芽生血管形成和血管拟态生成[5-6]。关于芽生血管形成和血管拟态在LUAD中的作用目前尚未阐明,该研究通过检测LUAD患者外周血VEGFA和MMP-14水平及其与LUAD患者临床病理特征的相关性,探讨两类血管生成方式在LUAD生长、侵袭与转移中的作用与临床意义,并利用生物信息分析数据库分析其表达情况及与生存预后的关系,为临床提供参考。

1 材料与方法

1.1 数据来源采用UALCAN(ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html)数据库分析LUAD MMP-14和VEGFA蛋白表达,TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov)数据库分析LUAD MMP-14和VEGFA mRNA表达及其与生存预后相关性。

1.2 研究对象收集安徽医科大学第二附属医院2022年1—7月收治的69例患者(所有患者为经病理证实的初诊患者)的血清和临床资料,其中男44例,女25例,年龄53～85岁,平均年龄(66.88±8.96)岁。其中LUAD早期患者(Ⅰ+Ⅱ期)11例,LUAD晚期患者(Ⅲ+Ⅳ期)58例。选择同期20例健康个体为对照组,其中男12例,女8例,年龄54～75岁,平均年龄(65.85±7.10)岁。纳入标准:所有患者均根据临床表现、影像学、病理及实验室检查确诊;对照组在安徽医科大学第二附属医院体检中心进行体检,结果正常,患者无其他类型肿瘤,无心、肝、肾等重要器官疾病。实验经过受试者知情同意并经安徽医科大学第二附属医院伦理委员会批准(编号:YX2022014)。

1.3 仪器与试剂MMP-14试剂盒购于美国Omnimabs公司,VEGFA试剂购于威海威高生物科技有限公司,配套威海威高JR-1半自动化学发光免疫分析仪检测。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)试剂盒及校准品购于美国雅培公司,配套雅培化学发光免疫分析仪Alinity i。

1.4 方法收集研究对象空腹静脉血,3 500 r/min离心5 min后分装在一次性EP管,-80 ℃保存。实验前,先将试剂盒置于室温(18～25 ℃)30 min,严格按照试剂盒说明书进行实验操作。ELISA法检测样本血清中MMP-14水平,使用酶标仪在450 nm波长处定量检测。化学发光法检测样本血清中VEGFA水平,若有样本结果大于检测上限,则用样本稀释液稀释10倍后重测。

2 结果

2.1 LUAD组织MMP-14和VEGFA蛋白表达情况UALCAN数据库中分析LUAD组织MMP-14和VEGFA蛋白表达情况,结果显示,原发性LUAD患者肿瘤组织中MMP-14和VEGFA蛋白水平均高于对照组(P<0.001),见图1。

图1 LUAD组织MMP-14和VEGFA蛋白表达情况

2.2 LUAD患者血清MMP-14和VEGFA表达水平LUAD早期组、晚期组和对照组在性别、年龄、吸烟史间差异均无统计学意义(P>0.05)。三组受试者血清MMP-14(Z=16.207,P<0.001)及VEGFA(Z=25.494,P<0.001)表达水平之间差异均有统计学意义。血清MMP-14表达水平在LUAD早期组高于对照组,差异有统计学意义(Z=-2.684,P=0.006),LUAD晚期组略高于LUAD早期组,但差异无统计学意义(Z=-0.820,P=0.412);血清VEGFA表达水平在LUAD早期组高于对照组(Z=-2.271,P=0.023),且LUAD晚期组高于LUAD早期组(Z=-2.082,P=0.037),差异均有统计学意义。见表1、图2。

表1 受试者基本信息及血清MMP-14、VEGFA表达水平比较

图2 LUAD晚期组、LUAD早期组及对照组血清MMP-14、VEGFA表达水平A:受试者血清MMP-14水平比较;B:受试者血清VEGFA水平比较;与对照组比较:*P<0.05;与LUAD早期组比较:#P<0.05

2.3 MMP-14和VEGFA表达水平与LUAD临床病理特征相关性LUAD患者血清MMP-14水平在T3/T4期水平高于T1/T2期(Z=-2.002,P=0.045),N2/N3期高于N0/N1期(Z=-2.106,P=0.035),胸膜转移组高于未转移组(Z=-2.118,P=0.034),差异均有统计学意义,在临床分期和M分期中差异无统计学意义(P>0.05);VEGFA水平在M1期高于M0期(Z=-2.234,P=0.025),在临床Ⅲ+Ⅳ期水平高于Ⅰ+Ⅱ期(Z=-2.082,P=0.037),在T和N分期中差异无统计学意义(P>0.05);血清MMP-14和VEGFA表达水平在不同性别、年龄、吸烟史、骨转移及脑转移组之间差异均无统计学意义(P>0.05),见表2。

2.4 VEGFA和MMP-14对LUAD的预测分析纳入性别、年龄、VEGFA和MMP-14指标构建多因素Logistic回归方程,结果显示,VEGFA水平升高将增加患LUAD的风险,MMP-14水平升高也将增加患LUAD的风险,但无统计学意义(OR=1.387,95%CI0.579～3.324,P=0.463);相对男性,女性不会增加LUAD发生的风险(OR=0.459,95%CI0.138～1.525,P=0.203);年龄的增长也不增加LUAD发生的风险(OR=0.980,95%CI0.909～1.057,P=0.608)。见表3。

表3 相关参数多因素Logistic回归分析结果

2.5 MMP-14、VEGFA单项或联合CEA对LUAD的诊断效能评估以对照组为参考,ROC分析显示,MMP-14、VEGFA和CEA单项诊断LUAD的曲线下面积(AUC)分别为0.793、0.849、0.851,95%CI分别为0.694～0.872,0.757～0.916,0.760～0.918,三者AUC之间两两比较,差异均无统计学意义;两项联合(MMP-14+VEGFA)及三项联合(MMP-14+VEGFA+CEA)检测AUC分别为0.893、0.952,95%CI分别为0.810～0.949、0.885～0.986,三项联合检测AUC均高于三项单项检测及两项联合,差异均有统计学意义。两项联合检测AUC高于三项单项检测,但差异无统计学意义。MMP-14、VEGFA、CEA、两项联合及三项联合检测诊断LUAD的最佳诊断界值分别为1.06 ng/ml、0.49 μg/ml、6.79 ng/ml、0.59及0.52,此时具有最佳诊断效能。见表4、5及图3。

表4 MMP-14和VEGFA单项和联合检测对LUAD的诊断效能

图3 MMP-14和VEGFA单项及联合检测诊断LUAD的ROC曲线两项联合:MMP-14+VEGFA;三项联合:MMP-14+VEGFA+CEA

2.6 MMP-14和VEGFA mRNA表达水平与LUAD患者预后的关系通过TCGA数据库分析MMP-14和VEGFA mRNA表达水平与LUAD患者生存预后的关系,以表达水平低于中位数的为低表达组,高于中位数的为高表达组。结果提示MMP-14和VEGFA mRNA高表达组的OS与DSS均低于低表达组(P<0.05),见图4。

表5 单项或联合检测诊断LUAD的ROC-AUC之间比较

图4 TCGA数据库分析MMP-14和VEGFA表达水平与LUAD患者OS和DSS的关系

3 讨论

通过生物信息分析大样本数据提示,LUAD患者肿瘤组织MMP-14和VEGFA 蛋白表达水平高于正常肺组织,体外血清试验也显示,LUAD患者血清MMP-14和VEGFA水平均高于对照组,Pietrzak et al[7]研究也显示,MMP-14在NSCLC患者的组织和血液表达水平均高于正常对照组。既往研究[8]显示,VEGFA在包括肺癌在内多种肿瘤中高表达,但也有研究[9]显示,正常肺组织中也高表达VEGFA。

新生血管形成在肿瘤生长和转移过程中起着决定性作用。肿瘤新生血管形成包括经典的内皮性血管芽生和血管拟态两种方式,VEGFA促进经典血管芽生,而MMP-14可促进肿瘤组织血管拟态形成,降解细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白并增强细胞迁移,从而促进肿瘤的侵袭性。本研究显示,LUAD早期和晚期组患者血清VEGFA和MMP-14表达水平均高于对照组。血清VEGFA表达水平在LUAD晚期组高于LUAD早期组,而MMP-14水平在LUAD早期和晚期患者之间差异无统计学意义,提示VEGFA和MMP-14在LUAD发生和发展过程中发挥一定作用。因此,推测经典的芽生式血管形成在LUAD的发生、发展及远端转移过程中发挥关键作用,而血管拟态更多地与LUAD生长及其向周围侵袭有关。

进一步研究显示,LUAD患者血清MMP-14水平在T3/T4期水平高于T1/T2期,N2/N3期高于N0/N1期,胸膜转移组高于未转移组,在临床分期和M分期中差异无统计学意义;VEGFA水平在M1期高于M0期,在T和N分期中差异无统计学意义。这些结果进一步验证了推测,即MMP-14可能与LUAD的生长及其向临近组织和淋巴侵袭有关,而肿瘤的远端转移更多与VEGFA有关。Xu et al[10]研究也表明非小细胞肺癌患者血清VEGFA水平高于对照组,但Liu et al[11]研究结果显示,VEGFA在非小细胞肺癌组织中的表达与肿瘤大小、恶性分化程度、TNM分期以及淋巴结转移呈正相关,笔者分析结果差异的原因可能与研究对象的差异有关,该研究以非小细胞肺癌整体作为对象,而本研究对象仅为LUAD。另外,MMP-14在LUAD组织中的表达高于正常组织[12],Yu et al[13]研究显示MMP-14表达与大肠癌的肿瘤分期相关,而关于MMP-14与LUAD的分期或转移的关系研究较少。因此,需要进一步研究探讨MMP-14在LUAD生长、侵袭和转移中的作用及其分子与细胞机制。

本研究纳入性别、年龄、VEGFA和MMP-14等指标构建多因素Logistic回归方程表明,MMP-14和VEGFA表达水平在不同性别、年龄、吸烟史、骨转移及脑转移组之间差异均无统计学意义。但是,VEGFA水平升高将增加患LUAD的风险(OR=7.517,P=0.002);MMP-14水平升高也将增加患LUAD的风险,但差异无统计学意义(OR=1.387,P=0.463)。这些结果提示血清VEGFA和MMP-14具有作为分子标记诊断LUAD的潜力。需要注意的是,本研究为小样本研究,因此在后续研究中需要进一步扩大样本量以验证MMP-14在LUAD中的风险评估价值。

本研究中ROC分析显示,血清VEGFA和MMP-14对LUAD均有一定诊断价值,AUC分别为0.849、0.793,与传统肿瘤标志物CEA诊断LUAD的AUC(0.851)相近,但三者之间两两比较差异无统计学意义。两项联合(MMP-14+VEGFA)及三项联合(MMP-14+VEGFA+CEA)检测AUC分别为0.893、0.952,两项或三项联合检测均可提高其对LUAD的诊断效能,但三项联合检测诊断效能最高,可提高诊断敏感性,且与单项检测和两项联合比较,差异均有统计学意义。两项联合检测与单项检测的AUC差异无统计学意义。研究还显示MMP-14、VEGFA、CEA诊断LUAD的最佳诊断界值分别为1.06 ng/ml、0.49 μg/ml、6.79 ng/ml,此时具有最佳诊断效能。

本研究通过TCGA数据库分析了LUAD患者MMP-14和VEGFA表达水平与生存预后的关系,结果显示MMP-14和VEGFA高表达组的OS与DSS均低于低表达组(P<0.05)。 Pietrzak et al[7]研究显示MMP-14表达高于中位数的患者的OS明显短于MMP-14表达低于中位数的患者,体外血清实验也显示MMP-14在T和N分期较晚的患者水平较高,说明MMP-14用于肺癌临床预后评估有一定意义。

综上所述,LUAD患者VEGFA和MMP-14水平异常高表达,VEGFA可能与LUAD远端转移有关,MMP-14可能与LUAD肿瘤生长、临近组织和淋巴侵袭相关。血清VEGFA水平升高对LUAD有较高预测价值,MMP-14和VEGFA对LUAD均有一定诊断价值,且联合CEA检测后可提高诊断LUAD的效能,生物信息分析提示MMP-14和VEGFA水平对LUAD生存预后有一定意义。