去铁酮对弓形虫慢性感染小鼠肝损伤中铁代谢紊乱的治疗作用

刘 敏,高南南,王 崇,蔡亦红

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种能在绝大多数温血动物中传播的专性胞内寄生虫[1]。免疫力正常的人群感染弓形虫后,一般不会出现明显的临床症状,但是在免疫力受损个体,如艾滋病患者[2]等,潜伏的虫体会被再次激活,从而引起弓形虫病,甚至致命。铁(Fe)是人体必须的微量元素,其主要储存在肝脏中。既往研究表明铁是宿主与病原体相互作用的关键调节剂之一[3],如细菌必须从宿主体内摄取铁才能完成自身的增殖从而引起疾病[4]。本课题组前期研究[5]表明,弓形虫感染可影响小鼠体内诸多器官中多种金属元素的组织留存,但是肝脏中铁元素的改变在弓形虫肝病中的研究尚未见报道。1,2-二甲基-3-羟基-4-酮(deferione,DFP)是美国EMA和 FDA批准使用的药物,被广泛应用于治疗铁过载及其相关疾病。有研究[6]表明,DFP对输血性铁过载和去除心脏中铁过载都有很好的疗效。此外,DFP、去铁胺等铁螯合剂能从疟原虫寄生的细胞中降低铁含量来抑制虫体的生长[7]。

铁蛋白是体内广泛存在的铁贮存蛋白,是由不同比例的24个肽亚基组成的纳米笼构成,在铁代谢中起重要作用。γ干扰素(γ interferon,IFN-γ)是由肝巨噬细胞分泌并位于肝窦内表面的细胞因子,其负责诱导肝脏损伤,引起炎症反应[8]。该研究利用我国优势基因虫株Chinese1型弱毒株TgCtWh6构建弓形虫慢性感染模型,检测小鼠肝脏中多种元素组织留存情况,观察DFP对弓形虫慢性感染小鼠肝脏铁代谢的影响,探讨弓形虫感染导致肝损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 弓形虫我国流行的弓形虫Chinese1的优势基因型TgCtwh6虫株来自人兽共患病安徽高校省级重点实验室,通过小鼠传代保种。

1.2 实验动物6周龄雌性C57BL/6雌鼠分为4组,每组6只,20～25 g,按照安徽医科大学《研究动物护理和使用指导原则》进行饲养,正常采食饮水。饲养的环境温度保持在20～25 ℃,相对湿度为40%～70%。

1.3 主要试剂浓硝酸(HNO3,优级纯)和30%双氧水(30%H2O2,分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司;20 mg/L 24种多元素混合外标溶液、2 μg/L 7种多元素混合内标溶液购自国家有色金属及电子材料分析测试中心;实验用水为超纯水(18.25 MΩ);SteadyPure通用型RNA提取试剂盒、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)主要试剂和蛋白标志物购自湖南艾科瑞生物工程有限公司;TRIzol、oligo(dT)磁珠、逆转录酶、dUTP Solution购自美国赛默飞公司;Western blot配胶主要试剂购自上海碧云天生物技术有限公司;BCA检测试剂盒购自山东思科捷生物技术有限公司;鼠源辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的甘油醛-3-磷酸脱氢(glyceraldehyde-3-phosphatedehydroge-nase,GAPDH)单抗购自武汉三鹰生物技术有限公司;引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成,内参引物GAPDH由上海生工合成,见表1。

表1 qRT-PCR反应引物

1.4 主要仪器Clin-CP-QMS-Ⅰ微量元素分析仪(北京毅新博创生物科技有限公司),DigiBlock电热消解仪(ST36-iTouch)(北京莱伯泰科仪器股份有限公司),ME 104分析天平(上海梅特勒-托利多有限公司),HK-UV-20型纯水仪(合肥宏科科技有限公司),微量紫外分光光度计(美国赛默飞公司),LightCycler®96实时荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司),TBA法(南京建成生物工程研究所有限公司),Infinite 200 PRO多功能微孔板酶标仪(上海帝肯贸易有限公司),电泳仪(北京六一公司),凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司)。

1.5 小鼠肝脏组织中的铁及其他金属元素的检测将冷冻后的肝组织取出,用超纯水冲洗2～3次,然后用滤纸将肝脏组织表面的水分吸干,精确称取0.05 g的肝脏组织,用混合的消化液,体积比为硝酸 ∶双氧水=2 ∶1,在电热消解器中消解,再用超纯水进行定容。经Clin-ICP-QMS-Ⅰ微量元素分析仪测定并计算铁元素及其他金属元素含量,铁元素(其他金属元素)含量=CV/m,其中C为样品中铁元素(其他金属元素)浓度(μg/ml),V为样品定容体积(ml),m为样品质量(g)。

1.6 qRT-PCR检测小鼠肝脏中Fth和IFN-γ相对浓度根据RNA提取试剂盒的方法,从小鼠肝组织中提取 RNA,利用微量紫外分光光度计测量RNA的浓度,然后将合成的cDNA于-20 ℃保存,将其余RNA于-80 ℃保存。10 μl逆转录体系:5×Evo M-MLV RT Master Mix 2 μl,依据RNA浓度添加RNA(500 ng总RNA),无酶水补足至10 μl;反应条件:37 ℃15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃。10 μl qRT-PCR反应体系:2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 5 μl、cDNA模板2 μl、Premix F 0.3 μl、Premix R 0.3 μl,无酶水补足至10 μl;反应条件:95 ℃ 10 min预变性,95 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s,共40次循环。基于内参基因GAPDH分析PCR结果,并通过2-ΔΔCt方法计算基因相对表达水平。

1.7 Western blot检测小鼠肝脏中Fth和IFN-γ相对浓度取小鼠约50 g肝脏组织,加入RIPA裂解缓冲液提取总蛋白,通过 BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白煮沸变性后用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)对4组小鼠肝组织进行测定,然后用标准程序转移到硝酸纤维素膜上。用5%脱脂牛奶封闭1.5 h,封闭完成后用TBST洗膜3次,每次10 min。在4 ℃下与兔源IFN-γ或Fth(稀释1 000倍)孵育过夜后,用TBST洗膜3次,每次10 min。在室温条件下孵育二抗1.5 h(1 ∶10 000稀释),再用TBST洗膜3次,每次10 min,最后用凝胶成像仪成像,其结果采用ImageJ 1.8.0软件对Western blot进行分析。

1.8 统计学处理采用GraphPad Prism 6.02软件进行统计分析,多组间比较采用单因素方差分析,两两间比较采用LSD法,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠肝脏组织中Fe2+含量经ICP-MS检测发现,4组小鼠肝脏中Fe2+含量差异有统计学意义(F=13.22,P<0.05)。与control组相比,control+DFP组小鼠肝脏组织中Fe2+含量明显上调(P<0.05),control组与TgCtwh6组相比,发现TgCtwh6组小鼠肝脏中Fe2+含量明显上调(P<0.05)。经DFP治疗后,TgCtwh6+DFP组肝脏中的Fe2+含量与TgCtwh6组相比显著降低(P<0.05),见图1A。

图1 肝脏中各种金属元素含量水平

2.2 小鼠肝脏组织中多种金属元素含量通过ICP-MS检测发现,4组小鼠肝脏组织中的Al、Cu、Mn、Zn、Mg五种金属元素,除了Zn和Mn元素在TgCtwh6组有所上调以外(P<0.05),其余组间差异无统计学意义(P>0.05),见图1B。

2.3 小鼠肝脏组织中Fth mRNA相对表达量通过qRT-PCR检测发现,4组小鼠肝脏组织中Fth mRNA表达差异有统计学意义(F=74.70,P<0.05)。与control组相比,control+DFP组小鼠肝脏组织中Fth mRNA含量无明显变化(P>0.05)。control组与TgCtwh6组相比小鼠肝脏组织中Fth mRNA含量上调(P<0.05)。在使用DFP后,与感染组相比,Fth mRNA的表达无明显变化(P>0.05)。见图2。

图2 四组小鼠肝脏中Fth、IFN-γ mRNA相对表达量

2.4 小鼠肝脏组织中IFN-γ相对表达量qRT-PCR检测发现,4组小鼠肝脏组织中IFN-γ相对表达量差异有统计学意义(F=368.5,P<0.05)。与control组相比,control+DFP组小鼠肝脏组织中IFN-γ含量差异无统计学意义(P>0.05)。TgCtwh6感染后,小鼠肝脏组织中IFN-γ含量上调(P<0.05),TgCtwh6组与TgCtwh6+DFP组相比小鼠肝脏组织中IFN-γ含量下调(P<0.05),见图2。

2.5 小鼠肝脏组织中Fth蛋白检测结果4组小鼠的Fth蛋白相对表达量差异有统计学意义(F=18.3,P<0.05)。Western blot检测发现control组和control+DFP组Fth蛋白含量相比差异无统计学意义(P>0.05),与control组相比,TgCtwh6组Fth蛋白含量明显上调(P<0.05),应用DFP后,TgCtwh6+DFP组的小鼠肝脏中Fth蛋白含量明显下调(P<0.05),见图3。

图3 Western blot检测4组小鼠肝细胞中Fth、IFN-γ蛋白表达水平

2.6 小鼠肝脏组织中IFN-γ的检测结果4组小鼠IFN-γ的相对表达量差异有统计学意义(F=142.3,P<0.05)。Western blot检测显示,control组和control+DFP组相比,IFN-γ表达差异无统计学意义(P>0.05),但TgCtwh6组与control组相比IFN-γ含量明显上调(P<0.05),与TgCtwh6组相比,TgCtwh6+DFP组的小鼠肝脏中IFN-γ含量明显下调(P<0.05),见图3。

3 讨论

肝脏在铁代谢中发挥重要作用,它不仅是铁元素的主要储存场所,也参与铁运输和铁稳态调节的复杂分子体系[9]。弓形虫可以在肝细胞中寄生,造成肝脏受损,影响肝组织中微量元素的稳定,干扰机体蛋白质及酶的合成以及相关的生化反应[10]。健康小鼠体内的铁代谢与储存处于一个平衡状态,在服用DFP后肝脏中铁元素含量上升,推测可能是由于DFP与Fe3+具有亲和力,其结合形成的复合物在广泛的 pH 值范围内稳定,能快速通过细胞膜而清除细胞内的铁,再通过尿液排出[11]。由于DFP螯合了肝脏中一部分游离的Fe3+,影响了健康小鼠肝脏内铁的平衡,促使肝脏进一步加快对铁的吸收,造成肝脏中铁元素含量上升,但其具体机制仍然需要进一步研究。弓形虫寄生于机体内,为满足自身生长繁殖,就必须从宿主体内摄取微量金属元素,宿主自身细胞为清除虫体也会影响微量金属元素的含量,寄生虫与宿主之间的相互作用势必会打破原有的微量金属元素平衡[12]。弓形虫感染后小鼠肝脏组织中铁元素含量上升,造成铁代谢紊乱。对感染小鼠给予DFP治疗后,肝脏组织中铁元素含量显著下降。提示DFP可有助于改善弓形虫感染所导致的铁紊乱。

肝脏内可贮存和代谢部分铁,铁水平变化可影响肝脏损伤的发生和发展,因此肝脏中铁蛋白水平可以很好地反映肝脏的损伤程度。铁蛋白的肽亚基包括Fth和铁蛋白轻链(ferritin light chain,Ftl)两种类型,并且Fth中的含铁量高于Ftl[13]。相关研究表明Fth水平与肝脏多种疾病的发生和发展呈正相关[14],同时,Fth还具有铁氧化酶活性[15],可以将Fe2+氧化成Fe3+,将多余的铁储存在纳米铁蛋白中,阻止铁过量造成的器官损伤[16]。因此课题组检测Fth蛋白用于衡量实验中各组小鼠的肝脏对铁的代谢能力,以此来评估小鼠的肝脏损伤程度。本研究显示,弓形虫慢性感染可以上调小鼠肝组织中Fth蛋白表达水平,但经DFP治疗后促进了肝脏组织铁的排泄,使肝脏组织中铁蛋白含量下调。

弓形虫可导致肝脏炎症和脂质过氧化[17],机体受到弓形虫感染后免疫细胞被激活释放炎症因子如IFN-γ。有研究[18]表明,IFN-γ能够激活肝内皮细胞的NF-κB信号途径,诱导肝细胞调亡,上调炎性基因表达,损害肝脏细胞。本研究显示,经过DFP治疗后的小鼠可以下调肝组织中IFN-γ的表达水平。既往研究[19]显示,使用DFP干预后可减轻非酒精性脂肪肝病小鼠肝脏的炎症因子含量,进而改善非酒精性脂肪肝病。由此可知DFP可有效缓解肝脏的炎症反应,减少炎症因子的产生。

在本研究中,TgCtwh6组与control组相比,其肝脏细胞中Fth mRNA含量明显上调,但Western blot结果显示,与TgCtwh6组相比,TgCtwh6+DFP组Fth蛋白含量明显下调,其肝脏细胞中铁元素含量也减少,造成这种情况的原因可能是:① 过量的铁在合成Fth蛋白过程中被排出。细胞中铁含量过高会刺激Fth mRNA部分翻译[20],但由于TgCtwh6组小鼠在服用DFP后促进了肝脏中铁排泄,使得TgCtwh6+DFP组与TgCtwh6组相比细胞中铁含量明显减少,这也相应导致了TgCtwh6+DFP组的Fth蛋白合成量下调,但由于只是翻译部分的Fth mRNA,因此TgCtwh6组和TgCtwh6+DFP组两组的Fth mRNA无明显变化。② 细胞中的炎症因子对Fth mRNA的转录具有刺激作用[21],炎症因子诱导转录Fth蛋白,相关研究[22]表明炎症可以影响Fth mRNA的翻译的,因此使Fth蛋白的合成量也发生改变。本次实验检测TgCtwh6+DFP组小鼠肝脏中IFN-γ的含量,其与TgCtwh6组相比明显下调,且IFN-γ等炎症因子可以影响Fth mRNA的翻译[19],TgCtwh6+DFP组在服用DFP后减轻了肝脏细胞的炎症反应,导致肝脏细胞分泌的IFN-γ含量减少,因此对Fth mRNA的刺激转录作用减轻,使部分细胞进入翻译沉默,这也导致了TgCtwh6+DFP组与TgCtwh6组相比Fth mRNA含量无明显变化但Fth蛋白的合成减少,这与课题组用Western blot检测肝脏细胞中的Fth蛋白结果吻合。