钙黏蛋白-11:钙化性主动脉瓣疾病的潜在治疗靶点

李鸿德 李君丽 廖延标 陈茂

随着人口老龄化进程加快,钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)已然成为了当今老年人群中最常见的心脏疾病之一,5年内患者发生心力衰竭、主动脉瓣置换或死亡的风险高达80%,是家庭和社会的沉重负担。临床现阶段依然缺乏可阻止或延缓CAVD进展的药物,唯一行之有效的治疗方式仍是主动脉瓣植入术[1]。但多种并发症如术后永久起搏器植入、终身抗凝、再次手术等问题使得CAVD的治疗仍是临床一大挑战[2]。因此,剖析CAVD的进展机制并探寻有效的早期缓解其进展的防治新靶点是该领域亟待解决的瓶颈问题,亦是研究重点。

CAVD以脂质沉积、慢性炎症调控及进展性钙化为主要病理进程,以主动脉瓣小叶增厚、瓣环狭窄、左心室机械应力增加为主要病理改变。CAVD发病机制复杂,目前认为血液流体力学异常改变[3]、细胞外基质(ECM)异常重构[4]、瓣膜细胞主动成骨分化[5]、遗传背景差异[6]均与CAVD进展相关。尽管CAVD与冠心病的危险因素(如高血压、糖尿病和血脂异常)具有相似性[7-8];但他汀类药物[9]与依折麦布[10]并不能延缓CAVD的进程,提示CAVD具有更独特的发病机制,需要进一步寻找潜在分子靶点。近来研究显示,钙黏蛋白(CDH)家族中钙黏蛋白-11与CAVD的多个进展机制密切相关,如其异常高表达是体外钙化结节形成的必要条件[11]。若诱导CDH-11过表达,可导致ECM重塑,驱动肌成纤维细胞样表型出现而诱导主动脉瓣钙化[12];抑制其表达则可延缓主动脉瓣小叶的增厚与钙化[11]。CDH-11可通过多种途径参与CAVD进展,提示其作为CAVD潜在治疗靶点的可能性。本文对近年来CDH-11在CAVD中作用的研究进展进行综述,并对其介导CAVD进展的分子机制进行总结,以揭示其作为CAVD防治靶点的应用前景,为后续研究及临床治疗提供参考。

一、CDH-11在主动脉瓣中的功能概述

1.主动脉瓣与CDH概述

主动脉瓣由瓣膜间质细胞(VICs)、瓣膜内皮细胞(VECs)与ECM构成,解剖结构分为3层:靠近主动脉面的胶原纤维层、中间富含糖胺聚糖的海绵层及心室面富有弹性蛋白的心室层。其中VICs在瓣叶的3层结构中均有分布,而VECs则覆盖在与血液接触的瓣叶表面。VECs和VICs的结构完整、细胞间通讯正常对主动脉瓣的组织稳态和功能正常维持至关重要。

具有维持细胞间连接、细胞间通讯、实体组织稳态作用的CDH-11由5个细胞外结构域、1个单跨膜结构域和1个细胞质尾部结构域组成,因缺乏组氨酸-丙氨酸-缬氨酸(HAV)三肽基序和两种保守的N末端色氨蛋白,被分类为Ⅱ型经典CDH,亦为目前已知的唯一可介导细胞-细胞/细胞-基质黏附的CDH。CDH-11最早在小鼠成骨细胞中被发现[13],因此亦被称作成骨细胞CDH。相关研究在人的胎盘、脑、肺脏和心脏中检测到CDH-11的mRNA转录物,但其在人体的组织分布暂无确切结论[14]。CDH-11可通过P120连环蛋白与β-连环蛋白、α-连环蛋白结合,进而与细胞骨架结合,在相邻细胞间形成同源二聚体继而发挥作用[15],如驱动肌成纤维细胞样表型出现、促进间充质细胞成骨分化,促进软骨成骨。

2.CDH-11与VECs

覆盖于瓣叶表面的VECs能够感受血流动力学、转导机械信号,通过改变趋化因子分泌影响VICs信号传导。功能完好的VECs有助于维持VICs处于静息状态,内皮功能障碍通常是CAVD的早期迹象。主动脉瓣开放时,心室面VECs处于单向层流的高剪切应力环境;瓣膜关闭时,主动脉面VECs则暴露于振荡性的低剪切应力中。持续的低振荡流血流动力学模式极易导致VECs受损,使其失去抑制VICs向肌成纤维细胞分化的能力,发生瓣膜钙化[16]。这可能是钙化最先发生于瓣叶主动脉侧的原因。

CDH-11通过连环蛋白锚定在VECs肌动蛋白细胞骨架上,具有ECM同亲型结合特性,能够维持内皮细胞单层完整性。且在生理情况下,处于单向层流条件下的心室面VECs中CDH-11表达低于处于低振荡流模式下的主动脉面VECs。这一特点可能是钙化起始于主动脉侧的机制,Jonhson等[16]以胶原收缩试验验证了这一结果,与VICs-VICs共培养组相比,主动脉侧VECs-VICs共培养组胶原收缩程度远强于心室面VECs-VICs共培养组。Butcher等[17]亦发现,作为机械敏感性蛋白,相较于静态,CDH-11在层流应力中表达升高。由此可知,正常情况下CDH-11有助于维持VECs功能完整,其异常高表达则可能与CAVD进程相关。

3.CDH-11与VICs

VICs是瓣膜中的主要细胞群,静息状态下呈成纤维细胞样表型,主要分泌适度的ECM维持瓣膜稳态[18],其成为活化表型包括肌成纤维细胞样VICs及成骨细胞样VICs驱动了CAVD进展,并导致其后的瓣膜钙化和狭窄。如前所述,CDH-11异常高表达的内皮细胞共培养促进了VICs肌成纤维活化程度[16]。据报道,瓣膜中CDH与整合素相互作用介导的细胞-细胞黏附和细胞-基质黏附对于维持瓣膜完整性至关重要[12]。在瓣膜发育过程中,胚胎早期时CDH-11可表达于主动脉瓣的分化源头—心室流出道心内膜垫的间充质细胞,但在胚胎晚期及出生后则仅表达于瓣膜内皮细胞[19]。同样,健康人群主动脉瓣中也仅在内皮细胞中观察到CDH-11表达,但在高脂饮食诱导的小鼠主动脉瓣钙化组织和钙化的人主动脉组织中,则可出现CDH-11的重新表达[19]。

综上所述,除胚胎发育早期与CAVD病变的主动脉瓣,CDH-11仅表达于VECs而非VICs;VICs高表达CDH-11往往伴随主动脉瓣钙化,这一特殊现象提示CDH-11与CAVD的密切关联性;CDH-11与CAVD如何相关及其是否可作为CAVD的前景性治疗靶点有待进一步研究。

二、异常高表达的CDH-11介导CAVD发展的分子机制

1.CDH-11通过介导VICs出现肌成纤维细胞样表型而参与CAVD进程

VICs肌成纤维细胞样表型出现伴随胶原沉积和ECM重塑,过量的胶原沉积导致瓣膜组织的纤维化和硬化[20],而CDH-11可介导ECM重塑而参与CAVD进程。Sung等[12]发现CDH-11过表达的10月龄小鼠主动脉瓣中即表现出大量的胶原沉积、广泛的ECM重塑及显著的瓣叶增厚,伴随着肌成纤维细胞标志物的表达增加,其机制为CDH-11/RhoA/Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶(ROCK)/Sox9通路轴的明显激活;与体内研究结果一致,他们在体外培养的猪主动脉VICs中亦发现CDH-11过表达可诱导其出现明显的肌成纤维细胞活化表型,以细胞迁移率和胶原收缩程度增加为特点,伴随ROCK通路活性增加[12]。甚至,即便不在VICs中上调CDH-11表达,仅将高表达的CDH-11 VECs与VICs共培养,亦可驱动VICs出现肌成纤维细胞样表型[16]。上述研究结果均表明CDH-11异常表达参与了CAVD进程。抑制其表达是否可缓解VICs肌成纤维细胞样活化而延缓CAVD的进程尚不清楚。Hutcheson等[11]使用小干扰RNA敲低猪VICs中CDH-11后发现钙化结节几乎完全消失。且Clark等[21]以CDH-11抗体阻断其功能,显著抑制了高脂饮食诱导的主动脉瓣增厚。同样,Wang等[22]在猪主动脉VICs中发现,予CDH-11抗体处理可显著缓解VICs的肌成纤维样细胞表型程度,但以小干扰RNA敲低CDH-11水平未得到相似结论。Bowen等[23]发现小鼠全身性的CDH-11敲除可抑制RhoA-GTP活性而降低β1整合素表达。Bowler等[24]发现小鼠CDH-11的敲除不仅可使ECM胶原沉积与炎症标志物(包括IL-6)的表达降低,且肌成纤维细胞及成骨样细胞水平均减少。除中和抗体外,以U0126(一种特异性MEK1/2抑制剂,可抑制CDH-11表达)降低CDH-11表达亦可减少主动脉瓣中的胶原沉积和ECM重塑[11,24]。综上可知,众多研究证实CDH-11可通过介导VICs出现肌成纤维细胞样表型而参与CAVD进程。

2.CDH-11通过介导VICs出现成骨细胞样表型而参与CAVD进程

在因瓣膜反流或狭窄而进行外科换瓣手术的患者中,83%伴有瓣膜钙化[25]。这与VICs在病理条件下激活时,不仅出现肌成纤维细胞样表型,也分化为成骨细胞样表型有关。CAVD患者的瓣膜中可同时鉴定出成纤维细胞样VICs及成骨细胞样VICs,成骨细胞样VICs主要介导钙盐沉积。如上所述,CDH-11高表达可介导VICs向肌成纤维细胞分化而参与CAVD进程,CDH-11表达水平是否与CAVD进程中VICs成骨细胞样表型有关有待探究。

相关研究发现,相比非钙化瓣膜,钙化人群瓣膜组织中CDH-11基因表达水平上调约50倍,且CDH-11阳性细胞与肌成纤维细胞和成骨样细胞标志物均高度共定位[11,19]。Sung等[12]研究结果表明CDH-11可通过激活RhoA信号传导增加细胞对机械张力的敏感性,进而促进VICs分化为成骨样细胞,导致主动脉钙化并出现狭窄,可由主动脉瓣峰值流速增加、成骨标志物上调及硝酸银/茜素红染色阳性而证明。Vaidya等[26]发现转基因小鼠中CDH-11过表达可通过Rac1调节runt相关转录因子2(Runx2)和定位诱导主动脉瓣狭窄。Hutcheson等[11]报道,CDH-11主要为肌成纤维细胞的聚集和钙化提供必要的细胞间张力,因而其高表达是转化生长因子(TGF)-β1诱导VICs钙化结节出现所必需的。作者认为,TGF-β1诱导活化的VICs过表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和CDH-11两种机械转导蛋白,α-SMA的上调导致细胞易于收缩,同时CDH-11表达增加使细胞间连接更为紧密,二者协同导致细胞间产生力的不平衡;这种不平衡伴随主动脉瓣正常形变而加剧,导致较弱细胞发生凋亡,并产生聚集体、起始钙化[27]。

不仅在各种病理刺激诱导的CAVD模型中,在遗传背景所致的CAVD进程中亦有CDH-11的参与。如NOTCH1基因现被认为与CAVD的进展密切相关,即便其单个杂合无义突变,亦可因失去对Runx2的抑制功能而导致患者主动脉瓣严重钙化[28]。NOTCH1+/-突变导致鼠主动脉瓣VICs中CDH-11表达增加,提示NOTCH1基因突变背景下所致CAVD进程与CDH-11存在潜在联系[11,29]。随后Clark等[19]发现腹腔注射CDH-11的靶向阻断抗体SYN0012可减轻NOTCH1突变所致的主动脉瓣钙化,表现为6月龄时小鼠主动脉瓣Movat染色/硝酸银染色标识的瓣膜钙化更少。综上所述,高表达的CDH-11可通过介导VICs出现成骨细胞样表型而参与CAVD进程。

三、靶向CDH-11及其下游机制的CAVD治疗前景

1.其他疾病中靶向CDH-11研究进展与治疗策略

CDH-11在纤维化疾病包括肺纤维化、肝纤维化、结肠炎相关纤维化与类风湿关节炎进展中均发挥重要促进作用[30]。在心脏中,靶向CDH-11亦可抑制JNK、Smad2/3、ERK1/2信号通路激活,阻断血管紧张素Ⅱ诱导的心房成纤维细胞分化为肌成纤维细胞[31]。降低CDH-11水平可有效减轻系统性硬化症、类风湿关节炎、肺纤维化等疾病动物模型的症状,亦可改善心肌梗死后的结局[30]。因此,已有CDH-11相关抗体进行临床试验。令人遗憾的是,RG6125(一种抗CDH-11单抗)Ⅱ期临床试验因其对类风湿性关节炎未显示出优于对照组的疗效而终止[32]。

2.CAVD中靶向CDH-11的治疗前景

尽管多种分子被发现参与CAVD进程,目前临床仍缺乏可延缓CAVD进展的分子靶向药物,究其原因与分子在模型中的作用稳定性及其开发的药物能否到达作用位点密切相关。如前所述,绝大多数文献均报道靶向CDH-11降低其表达水平或阻断其作用均可抑制CAVD进程,因此CDH-11已具备分子在模型中的作用稳定性。CDH-11为单次跨膜受体,这一特性使其具有局部靶向治疗潜力。如下所述,多种靶向CDH-11的动物治疗策略均收效甚佳。

以抗体SYN0012阻断CDH-11功能,可明显缓解NOTCH1+/-突变所致主动脉瓣钙化[21];以MEK1/2抑制剂U0126抑制CDH-11的表达,可减少主动脉瓣中的胶原沉积和ECM重塑[10,23]。除以抗体阻断CDH-11作用外,基因水平的干预措施亦可缓解CAVD进程,如小鼠全身性CDH-11敲除降低了其主动脉瓣钙化程度[23]。由此可见,靶向CDH-11动物治疗策略的有效性提示了以其为靶点进行药物开发的可行性,及其作为靶点药物用于临床试验乃至应用于临床CAVD治疗的前景性。

除靶向CDH-11本身,靶向其下游机制的治疗策略亦初见效果。CDH-11介导了RhoA、Rac1、ROCK等下游分子的激活,而上述分子的激活参与了CAVD进程[12,26]。ROCK抑制剂Y27632可于体外缓解VICs钙化[12]。同样,Rac1抑制剂NSC23766亦可有效阻止CDH-11介导的VICs钙化,进而在早期阻止主动脉瓣钙化的发生[26]。此外,成骨条件下以抑制剂ITX3靶向Trio(一种促进Rac1活化的CDH-11结合伴侣[33])也可有效预防CDH-11诱导的VICs钙化和Runx2表达。基于此,以CDH-11下游分子为靶点同样具有CAVD治疗的前景性。

四、总结与展望

鉴于现今CAVD是外科主动脉瓣置换术的主要原因,且临床缺乏可用的缓解/阻断性治疗药物,因而潜在前景性治疗靶点的开发及筛选极其重要。众多被发掘的潜在靶点中,CDH-11因其在不同学者及操作条件下均表现出的稳定作用(高表达促进主动脉瓣钙化进程,阻断其功能则抑制主动脉瓣钙化进程),因此是一种卓越的药物开发、疾病治疗靶点。但塞来昔布这类抑制环氧化物酶-2的非甾体类药物具有CDH-11的表达抑制性,反而增加猪VICs钙化程度的现象引人深思[34]。尽管后续研究证明塞来昔布诱导猪VICs钙化与药物CDH-11抑制作用无关,而与糖皮质激素效应激活MAPK信号有关[34]。总结而言,靶向CHD-11治疗CAVD虽然前景显著,但合适、不良反应更少、形式更多样的药物开发工作仍亟待解决,在药物开发过程中学者们需深思以规避临床试验中的潜在风险。