小分子化合物I942在UVB照射诱导人黑素细胞树突形成及黑色素合成的促进作用

石家绮 张丽萍 宋军 孙鸿 宋丹丹

[摘要]目的：探究小分子化合物I942在UVB照射诱导人黑素细胞树突形成及黑色素合成的促进作用。方法：使用浓度为0、3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L的小分子化合物I942处理正常永生化人表皮黑素细胞系PIG1，采用CCK-8法检测各组24、48、72 h时的细胞活力。将PIG1细胞分为对照组、UVB组、UVB+2.5μmol/L I942组、UVB+5μmol/L I942组、UVB+10μmol/L I942组，按照分组名称进行相应处理。多巴染色观察各组细胞形态，免疫荧光染色观察黑素小体及骨架蛋白F-actin分布情况，氢氧化钠裂解法测定黑色素含量，多巴氧化反应法测定酪氨酸酶活性。qRT-PCR、WB检测树突形态相关、黑色素合成相关mRNA与蛋白表达水平。结果：浓度为0、3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L的小分子化合物I942对PIG1细胞活力无明显影响（P＞0.05）。与对照组相比，UVB组、UVB+2.5 μmol/L I942组、UVB+5 μmol/L I942组、UVB+10μmol/L I942组细胞树突数量、gp100、F-actin、黑色素含量、酪氨酸酶活性、MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Rac1 mRNA与蛋白水平均升高（P＜0.05），RhoA mRNA與蛋白水平降低（P＜0.05）。结论：小分子化合物I942结合UVB照射诱导能够增加黑素细胞的树突数量，提高细胞黑色素含量，提升酪氨酸酶活性，促进黑色素合成。

[关键词]小分子化合物I942；黑素细胞；树突；黑色素合成；白癜风

[中图分类号]R758.41    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2023）06-0098-06

The Small Molecule Compound I942 Promotes the Formation of Dendrites and Melanin Synthesis in Human Melanocytes Induced by UVB Irradiation

SHI Jiaqi，ZHANG Liping，SONG Jun，SUN Hong，SONG Dandan

（Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Jiangnan University，Wuxi 214062，Jiangsu，China）

Abstract： Objective  Explore the effect of small molecule compound I942 on the promotion of human melanocyte dendritic formation and melanin synthesis induced by UVB irradiation. Methods  Treatment of immortalized human epidermal melanocyte cell line PIG1 cells with the small molecule compound I942 at a concentration of 0， 3.125， 6.25， 12.5， 25， 50 μmol/L. CCK-8 method to detect cell viability of each group at 24， 48， 72 h. PIG1 cells are divided into control group， UVB group， UVB+2.5 μmol/L I942 group， UVB+5 μmol/L I942 group， UVB+10 μmol/L I942 group. According to the group name for corresponding processing. Dopa staining to observe the morphology of each group of cells. Immunofluorescence staining to observe the distribution of melanosomes and skeleton protein F-actin. Determination of melanin content by sodium hydroxide pyrolysis method. Determination of tyrosinase activity by DOPA oxidation reaction method. qRT-PCR， WB detection of dendritic morphology-related， melanin synthesis-related mRNA and protein expression levels. Results  The small molecule compound I942 at the concentration of 0， 3.125， 6.25， 12.5， 25， 50 μmol/L has no significant effect on the viability of PIG1 cells （P＞0.05）. Compared with the control group， the number of cell dendrites， gp100， F-actin， melanin content， tyrosinase activity， MITF， TYR， TRP-1， TRP-2， Rac1 mRNA and protein levels increased in UVB group， UVB+2.5 μmol/L I942 group， UVB+5 μmol/L I942 group， UVB+10 μmol/L I942 group （P＜0.05）， and RhoA mRNA and protein levels decreased （P＜0.05）. Conclusion  The small molecule compound I942 combined with UVB irradiation can increase the number of dendrites of melanocytes， increase the melanin content of cells， increase tyrosinase activity， and promote melanin synthesis.

Key words： small molecule compound I942; melanocyte; dendrites; melanogenesis; vitiligo

白癜风是一种较为常见的原发、局限或泛发性的慢性色素脱失性皮肤病，患部皮损呈乳白色，表面光滑无皮疹，白斑有清晰境界[1]。白癜风全球发病率为0.06%～2.28%，好发于暴露及经常磨损部位，全身皮肤皆可发生，发病人群广，青壮年较多[2]。白癜风的具体发病机制目前尚未明晰，可能与遗传、自身免疫、精神与神经化学、黑素细胞自毁等因素相关[3-4]。黑素细胞的主要功能为合成黑色素并传递给周围的角质形成细胞，黑色素可停留在角质形成细胞的细胞核上，保护染色体免受紫外线辐射损伤[5]，因此在白癜风的治疗中，促进皮肤黑色素合成是非常重要的。光照疗法是治疗白癜风的主要方法之一，中波紫外线（Ultraviolet radiation b，UVB）可诱导毛囊神经嵴干细胞分化为黑素细胞，促进黑素细胞增殖迁移，增加黑色素合成[6]。黑色素合成受多条信号通路如环磷酸腺苷/蛋白激酶A（Cyclic adenosine monophosphate/Protein kinase A，cAMP/PKA）、活性氧/絲裂原活化蛋白激酶（Reactive oxygen species/Mitogen-activated protein kinase，ROS/MAPK）等调节，其中cAMP激活的交换蛋白（Exchange protein activated by cAMP，EPAC）与cAMP、MAPK通路联系紧密[7]。陈雅楠等[8]的研究表示EPAC可能与黑素细胞合成黑色素的过程相关。小分子化合物I942是EPAC激动剂，可提高EPAC分子活性，进而影响cAMP/EPAC通路[9]。本次研究将小分子化合物I942与UVB照射两者结合，观察其对正常永生化人表皮黑素细胞系PIG1（简称PIG1细胞）树突形成及黑色素合成的影响，结果报道如下。

1  材料和方法

1.1 细胞、试剂及仪器：PIG1细胞（货号AC340321），购自上海泽叶生物科技有限公司；人黑素细胞生长添加剂（货号S0025）、胎牛血清（货号16140063）、254培养基（货号M254500）、胰酶（货号15400054）、DAPI溶液（货号62248）、TRIzol试剂（货号15596018）、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（货号4368813）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，货号D2345）、SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物（货号34580），购自美国Thermo Fisher公司；小分子化合物I942（货号T24154），购自上海陶术生物科技有限公司；CCK-8试剂盒（货号C0038）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号P0012），购自上海碧云天生物技术有限公司；FITC标记鬼笔环肽（货号RM02836），购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒（货号RR820A），购自大连宝生生物科技有限公司；氢氧化钠（Sodium hydroxide，NaOH，货号S5881）、Triton X-100（货号X100）、多巴试剂（货号D9503）、RIPA试剂（货号R0278），购自美国Sigma公司；兔gp100抗体（货号ab137078）、小鼠F-actin抗体（货号ab205）、小鼠小眼畸形相关转录因子（microphthalmia-associatedtranscriptionfactor，MITF）抗体（货号ab3201）、兔酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）抗体（货号ab170905）、兔酪氨酸酶相关蛋白1（tyrosinase related protein 1，TYRP1）抗体（货号ab235447）、兔酪氨酸酶相关蛋白2（tyrosinase related protein 2，TYRP2）抗体（货号ab74073）、兔Rac1抗体（货号ab155938）、兔RhoA抗体（货号ab187027）及相应二抗购自美国Abcam公司。其他试剂均为市售分析纯。DHP-9272电热恒温培养箱，购自上海和呈仪器制造有限公司；紫外线光疗仪，购自上海希格玛高技术有限公司；光学显微镜、荧光倒置显微镜，购自德国Leica公司；酶标分析仪，购自北京普朗新技术有限公司；ABI 7500实时荧光定量PCR仪，购自南京贝登电子商务有限公司；Mini-PROTEAN Tetra电泳槽，购自美国伯乐公司；eBlot? L1快速湿转仪，购自南京金斯瑞生物科技有限公司；接触式无损定量成像仪，购自上海易孛特光电技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：使用人黑素细胞生长添加剂与5%胎牛血清的254培养基培养PIG1细胞，置于培养条件为37℃、5% CO2、饱和湿度的电热恒温培养箱进行培养。

1.2.2 CCK-8细胞增殖实验：观察PIG1细胞生长至对数期后用胰酶消化，调整细胞密度约为1×104/ml并接种于96孔板上培养过夜，每孔200μl。分别加入小分子化合物I942浓度为0、3.125、6.25、12.5、25、50μmol/L的254培养基继续培养，于培养至20、44、68 h时向每孔内加入15μl CCK-8溶液。培养至24、48、72 h后用酶标仪在450 nm波长下测定各孔吸光度。

1.2.3 细胞分组与处理：PIG1细胞分为对照组、UVB组、UVB+2.5μmol/L I942组、UVB+5μmol/L I942组、UVB+10μmol/L I942组。对照组不进行处理，其余分组接受UVB灯照射，照射剂量=UVB辐照度（mJ）×时间（s），选定100 mJ/cm2作为本次实验的照射剂量。照射前吸净原细胞培养液并用1×PBS清洗1次，再加入1×PBS覆盖细胞表面。照射完成后吸出1×PBS，按照分组加入对应浓度含小分子化合物I942的254培养基，置入培养箱继续培养48 h。1×PBS洗涤细胞3遍，每组加入2 ml 1%多巴溶液，37℃恒温孵育4 h，于光镜下观察各组细胞染色情况并拍照，使用Image J软件分析图像。

1.2.4 免疫荧光染色观察各组细胞黑素小体及骨架蛋白F-actin分布情况：各组细胞生长至对数期后常规胰酶消化，调整细胞密度约为2×104/ml。6孔板中置入无菌盖玻片，每片均匀滴加500μl细胞悬液，观察到细胞贴壁后每孔加入2 ml 254培养基，继续培养24 h。吸去6孔板中的培养基，用1×PBS清洗2遍，加入4%预冷丙酮，置于冰上固定10 min，1×PBS清洗2遍。加入1% BSA，室温孵育30 min后，加入1% BSA稀释的相应抗体，稀释比例1：100，置于4℃过夜。1×PBS清洗2遍，加入1% BSA稀释的荧光二抗，稀释比例1︰100，置于37℃避光环境中反应2 h。1×PBS清洗2遍，用1×PBS配制浓度为5μg/ml的FITC标记鬼笔环肽工作液，滴加置盖玻片表面，室温避光孵育30 min。5μl/ml DAPI染核10 min，1×PBS清洗2遍后于倒置荧光显微镜下观察并拍照，使用Image J软件分析图像。

1.2.5 各组细胞黑素含量测定：各组细胞生长至对数期后常规胰酶消化，收集细胞沉淀，加入含10% DMSO的1 mol/L NaOH溶液500μl，充分重悬后置入37℃水浴1 h，用酶标仪在450 nm波长下测定各孔吸光度。黑色素相对含量（%）=（各UVB+I942处理组OD值-空白对照OD值）/（对照组OD值-空白对照OD值）×100%。

1.2.6各组细胞酪氨酸酶活性测定：各组细胞生长至对数期后常规胰酶消化，收集细胞沉淀，加入1% Triton X-100溶液450μl，充分重悬后于-80℃环境内放置30 min，取出后于室温下裂解细胞。加入50μl 0.1%多巴溶液，37℃水浴2 h，用酶标仪在450 nm波长下测定各孔吸光度。酪氨酸酶相对活性（%）=（各UVB+I942处理组OD值-空白对照OD值）/（对照组OD值-空白对照OD值）×100%。

1.2.7 qRT-PCR检测各组细胞树突形态相关与黑色素合成相关蛋白mRNA表达水平：使用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，用反转录试剂盒转录成cDNA。由1μg cDNA模板、上下游引物各0.5μg和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒配制20μl PCR反应体系。反应条件：95℃预变性10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，循环40次。引物序列见表1。使用ABI 7 500实时荧光定量PCR仪完成RT-PCR操作，应用2-△△CT法计算各mRNA水平。

1.2.8 WB检测各组细胞树突形态相关与黑色素合成相关蛋白表达水平：各组细胞生长至对数期后常规胰酶消化，收集细胞沉淀，加入适量预冷RIPA充分裂解，4℃、10 000 rpm离心10 min，取上清液，BCA定量后制样。凝胶电泳分离样品蛋白，转膜，截取目的条带浸于5%脱脂奶粉制成的封闭液中，置于摇床上室温封闭1 h。用封闭液稀释一抗制成孵育液，稀释比例为1︰500。目的条带浸于孵育液中，充分摇匀后置于4℃环境下过夜。第2天取出膜，平衡至室温后洗膜，加入稀释比例为1︰5 000的对应二抗孵育液，室温孵育2 h，洗膜后加入ECL化学发光液，避光反应5 min，用定量成像仪收集结果。

1.3 统计學分析：使用SPSS 22.0软件对收集到的数据进行分析处理，计量资料用平均数±标准差（x?±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2  结果

2.1 不同浓度小分子化合物I942对PIG1细胞活力的影响：各组PIG1细胞活力随培养时间增加而提升，相同时间点不同浓度组间细胞活力差异无统计学意义（P＞0.05），且未出现明显抑制情况，说明PIG1细胞可于小分子化合物I942 0～50μmol/L浓度范围内正常增殖。见图1。

2.2 各组细胞形态变化：对照组PIG1细胞形态正常，经多巴溶液染色后呈黑色。与对照组相比，UVB组、UVB+2.5μmol/L I942组、UVB+5μmol/L I942组、UVB+10 mol/L I942组细胞树突数量增加，颜色加深。见图2。

2.3 免疫荧光染色结果：经免疫荧光染色，PIG1细胞核呈蓝色，骨架蛋白F-actin呈绿色，黑素瘤相关抗原gp100呈红色。与对照组相比，UVB组、UVB+2.5μmol/L I942组、UVB+5μmol/L I942组、UVB+10μmol/L I942组F-actin与gp100表达量均上升。见图3。

2.4 各组细胞黑色素含量测定结果：与对照组相比，UVB组、UVB+2.5μmol/L I942组、UVB+5μmol/L I942组、UVB+10μmol/L I942组黑色素含量上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

2.5 各组细胞酪氨酸酶活性测定结果：与对照组相比，UVB组、UVB+2.5μmol/L I942组、UVB+5μmol/L I942组、UVB+10μmol/L I942组酪氨酸酶活性上升，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

2.6 各组细胞qRT-PCR检测结果：与对照组相比，UVB组、UVB+2.5μmol/L I942组、UVB+5μmol/L I942组、UVB+10μmol/L I942组MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Rac1 mRNA水平升高，RhoA mRNA水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图6。

2.7 各组细胞WB检测结果：与对照组相比，UVB组、UVB+2.5μmol/L I942组、UVB+5μmol/L I942组、UVB+10μmol/L I942组MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Rac1表达量升高，RhoA表达量降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图7。

3  讨论

黑色素合成于黑素细胞的黑素小体内，通过酪氨酸酶催化酪氨酸氧化合成[10]。MITF参与调控黑素细胞的生长、分化，是色素生成的主要调节蛋白，可直接作用于基因的转录调节，激活TYR、TRP-1、TRP-2[11]。黑色素由TYR催化形成，TRP-1、TRP-2参与黑色素合成，具有维持酪氨酸酶在黑素体膜上的稳定、阻止未成熟的黑素细胞死亡等重要作用[12]。在本次研究中，UVB组细胞黑素含量、酪氨酸酶活性、MITF、TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA及蛋白水平均高于对照组。UVB照射能够促进角质形成细胞释放内皮素-1与碱性成纤维细胞生长因子，令黑素细胞增殖，还可使还原型黑色素氧化为黑色素，抑制皮肤树突状细胞和T淋巴细胞的免疫功能，保护黑素细胞[13-14]。黑素细胞分布于表皮基底层，通过树突结构运输其合成的黑素至邻近的角质形成细胞[15]。树突的数量、分叉情况、长短等变化均会对黑色素的运输造成影响，而树突结构的形成可受多种因素调节。多巴染色结果显示，UVB组树突数量较对照组更多，细胞颜色更深，gp100、P-actin、Rac1 mRNA与蛋白表达量更高，RhoA mRNA与蛋白表达量降低。Rac1和RhoA在黑素细胞骨架和树突形成方面起重要作用。活化Rac1可以促进树突的形成和延伸，而RhoA可通过其下游分子ROCK促进丝状肌动蛋白聚合，形成应力纤维，增强细胞张力及黏附能力，诱导树突退缩形成黏着斑[16-17]。UVB照射在刺激黑素细胞合成黑色素的同时还可促进骨架蛋白F-actin形成的应力纤维解聚，增加树突的数量与长度，并且促进黑素小体向树突末端转运，提高运输效率[18]。

小分子化合物I942是对EPAC1具有激动剂特性的非环核苷酸小分子。在本次研究中，浓度范围0～50μmol/L的小分子化合物I942均未表现出对PIG1细胞活力的影响；经浓度为2.5、5、10μmol/L的小分子化合物I942处理的三组细胞黑色素含量、酪氨酸酶活性、gp100、P-actin、MITF、TYR、TRP-1、TRP-2、Rac1 mRNA及蛋白水平均较UVB组更高，RhoA mRNA与蛋白较UVB组更低，说明小分子化合物I942具有促进黑素细胞树突形成、促进黑色素合成的能力。根据MITF、TYR、TRP-1、TRP-2 mRNA的水平变化推测小分子化合物I942通过调节MITF进而影响其下游的TYR、TRP-1、TRP-2，达到促进黑素细胞合成黑色素的效果。对比各项试验数值发现，10μmol/L I942对PIG1细胞的黑色素含量、酪氨酸酶活性等各项指标影响效果低于2.5μmol/L I942和5μmol/L I942的影响效果，其原因可能是高于5μmol/L的小分子化合物I942对其相关信号通路产生了抑制作用，但其具体抑制浓度与作用机制还有待进一步实验探究。

综上所述，小分子化合物I942结合UVB照射诱导能够增加黑素细胞的树突数量，提高细胞黑色素含量，提升酪氨酸酶活性，促进黑色素合成，为白癜风等色素脱失性疾病的治疗提供了新的理论依据。目前国内有关小分子化合物I942的研究较少，希望本次初步研究能够引起更多学者的关注，由此角度进行更多更为深入的研究。

[参考文献]

[1]邹雪莲，胡雯，康晓静.角质形成细胞与白癜风发病机制的相关研究进展[J].中国美容医学，2021，31（12）：178-181.

[2]Burlando M，Muracchioli A，Cozzani E，et al.Psoriasis，vitiligo，and biologic therapy：Case Report and narrative review[J].Case Rep Dermatol，2021，13（2）：372-378.

[3]Spritz R A，Santorico S A.The genetic basis of vitiligo[J].J Invest Dermatol，2021，141（2）：265-273.

[4]林士偉，魏茗蕾，孔静.晕痣患者中白癜风发生状况及其危险因素分析[J].中国美容医学，2020，29（12）：40-43.

[5]Moreiras H，Seabra M C，Barral D C.Melanin transfer in the epidermis：The pursuit of skin pigmentation control mechanisms[J].Int J Mol Sci，2021，22（9）：4466-4476.

[6]Dong D，Chen S，Feng C，et al.NB-UVB induces melanocytic differentiation of human hair follicle neural crest stem cells[J].Ann Dermatol，2020，32（4）：289-297.

[7]Hu S，Huang J，Pei S，et al.Ganoderma lucidum polysaccharide inhibits UVB-induced melanogenesis by antagonizing cAMP/PKA and ROS/MAPK signaling pathways[J].J Cell Physiol，2019，234（5）：7330-7340.

[8]陈雅楠，吴建华.小分子化合物I942对黑素细胞黑素合成的促进作用[J].第二军医大学学报，2020，41（2）：161-166.

[9]Wiejak J，van Basten B，Luchowska-Stańska U，et al.The novel exchange protein activated by cyclic AMP1 （EPAC1） agonist，I942，regulates inflammatory gene expression in human umbilical vascular endothelial cells （HUVECs）[J].Biochim Biophys Acta Mol Cell Res，2019，1866（2）：264-276.

[10]D'Alba L，Shawkey M D.Melanosomes：Biogenesis，properties，and evolution of an ancient organelle[J].Physiol Rev，2019，99（1）：1-19.

[11]Qian W，Liu W，Zhu D，et al.Natural skin-whitening compounds for the treatment of melanogenesis （Review）[J].Exp Ther Med，2020，20（1）：173-185.

[12]Lee J W，Han S J，Kang H Y，et al.On-off switching of cell cycle and melanogenesis regulation of melanocytes by non-thermal atmospheric pressure plasma-activated medium[J].Sci Rep，2019，9（1）：13400-13409.

[13]Ouyang Y，Chen J，Jiang L，et al.UVB-induced ciRS-7 activates melanogenesis by paracrine effects[J].DNA Cell Biol，2021，40（3）：523-531.

[14]Tse B C Y，Byrne S N.Lipids in ultraviolet radiation-induced immune modulation[J].Photochem Photobiol Sci，2020，19（7）：870-878.

[15]Lambert M W，Maddukuri S，Karanfilian K M，et al.The physiology of melanin deposition in health and disease[J].Clin Dermatol，2019，37（5）：402-417.

[16]Choi S G，Kim J H，Hong S H，et al.Exogenous pyruvate alleviates UV-induced hyperpigmentation via restraining dendrite outgrowth and Rac1 GTPase activity[J].J Dermatol Sci，2021，101（2）：101-106.

[17]Qi Y，Liang X，Dai F，et al.RhoA/ROCK pathway activation is regulated by AT1 receptor and participates in smooth muscle migration and dedifferentiation via promoting actin cytoskeleton polymerization[J].Int J Mol Sci，2020，21（15）：5398-5412.

[18]Seo S H，Kim S E，Lee S E.ER stress induced by ER calcium depletion and UVB irradiation regulates tight junction barrier integrity in human keratinocytes[J].J Dermatol Sci，2020，98（1）：41-49.

[收稿日期]2022-01-24

本文引用格式：石家綺，张丽萍，宋军，等.小分子化合物I942在UVB照射诱导人黑色素细胞树突形成及黑色素合成的促进作用[J].中国美容医学，2023，32（6）：98-103.