基于近红外光谱法快速同时测定天麻中4种成分含量的研究*

司凯元，严春荣，黄艳萍，孔德涛，杨晶晶，王羚航，刘祥义，侯 英**

(1.西南林业大学，云南 昆明 650224；2.玉溪市质量技术监督综合检测中心，云南 玉溪 653100)

天麻(GastrodiaelataBl.)又名赤箭、定风草、离合草等，为兰科天麻属真菌异养型多年生草本植物，以加工后的干燥块茎入药[1]。天麻被广泛应用于医药、保健品和滋补食品领域，具有较高的研究价值[2]。天麻中含有多种成分，通常天麻素和对羟基苯甲醇等酚类化合物被认为是天麻的主要成分，在2020年版《中国药典》(一部)[3]中规定以天麻素和对羟基苯甲醇含量为指标来评价天麻质量。巴利森苷类是由对羟基苯甲醇及其衍生物与柠檬酸聚合而成，其不仅含量高，且衍生产物多样，并具有改善记忆、抗抑郁等药理作用，也是天麻中一类重要的化学成分[4]。目前多采用高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱法等方法来测定天麻中主要成分[5-6]。鉴于中药材和中药饮片具有批次规模较小，质量受产地因素影响大，不同批次间主要成分含量差异大等特点，因此开发可用于现场测定的低成本、简单、快速的检测方法，成为提高中药材、饮片监管和检测效率的关键。

近红外光谱法是近年来分析化学领域发展较为迅速的光谱分析方法，已成熟应用于农业、制药、食品、石化和烟草等领域[7-8]的产品质量控制中。目前，应用近红外光谱技术对中药材和中药饮片进行定性和定量的研究已有相关报道。何淑华等[9]对吉林人参进行定性分析；李国辉等[10]对栽培和野生中药材灯盏花进行鉴别；李劲等[1]应用近红外光谱技术对小柴胡颗粒中的黄芩苷含量进行测定；赵艳丽等[12]应用近红外光谱快速鉴别不同产地药用植物重楼。但近红外光谱分析技术用于天麻中同时测定多种成分的报道较少。本研究收集116份不同产地的天麻样品，采用HPLC和HPLC-MS-MS法分别测定天麻中天麻素和对羟基苯甲醇、巴利森苷和巴利森苷B含量，并结合样品的近红外光谱，采用TQ 8.6分析软件分别建立天麻中4种成分的定量模型并采用外部验证对模型进行评价。相较于传统的高效液相色谱法测定，近红外光谱法快速测定天麻中4种主要成分的方法具有快速、准确、无损和绿色的优势，具有较好的实用性和推广应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

采集2021—2022年采收的不同产地天麻样品116份，经西南林业大学刘祥义教授鉴定为天麻干燥块茎，样品来源信息详见表1。以96个样品作为校正集，以优化和建立天麻中4种成分的定量模型。以20个样品作为验证集，以验证所建立校正模型的预测能力。

表1 样品来源信息

1.2 设备与材料

Antaris Ⅱ 近红外光谱仪(美国赛默飞世尔科技，漫反射模块，Result 2.1软件采集光谱图、TQ 8.6软件定量分析)；1290 Infinity高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；SIMCA-P+11.0软件(瑞典UMETRICS公司)；UltiMate 3000-TSQ FOPTIS高效液相-三重四级杆质谱仪(配ESI离子源)(美国Thermo公司)；DFT-100型中药粉碎机(浙江温岭市林大机械有限公司)；0.25 mm 不锈钢筛子(中西泰安公司)。

天麻素(>98%，批号：P1922434)和对羟基苯甲醇(>98%，批号：P2124258)购自上海泰坦科技股份有限公司；巴利森苷(>98%，批号：7857)购自上海诗丹德标准技术服务公司；巴利森苷B(>98%，批号：DST190901-063)购自成都德思特生物技术有限公司；乙腈、甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)；水为超纯水。

1.3 样品的制备

供试天麻样品采集后用自来水洗净，再用蒸馏水冲洗3次，将其切成薄片，隔水蒸制 15 min 后，常温下阴干，用中药粉碎机粉碎过 0.25 mm 筛。粉末样品量不少于 50 g，存放于自封袋中备用。

1.4 天麻4种成分的测定

天麻中天麻素和对羟基苯甲醇的含量测定按照《中华人民共和国药典》2020年版一部[4]天麻项下的含量测定进行。天麻中巴利森苷和巴利森苷B含量测定参考康传志[6]等的方法进行。

1.5 近红外光谱数据采集

采集样品近红外光谱前，将粉末状的天麻样品置于恒温恒湿箱中平衡 24 h，平衡样品水分含量在10%～12%之间。在近红外光谱仪器预热 2 h 后，使用Result 2.1软件漫反射模块采集天麻样品的近红外光谱。

称取平衡水分后的天麻样品 20 g，置于近红外采样杯中，压紧。近红外光谱采集条件为：扫描次数为64次，分辨率为 4 cm-1，扫描范围为 10000～4000 cm-1。每个样品平行测定3次，取平均光谱作为样品光谱，进行数据建模。

天麻样品的样品原始近红外光谱图见图1，从图中可看出，不同样品的近红外光谱图差异较小，仅在部分波段的吸收强度上有微小差异，需经一定预处理过程以提取特征信息。原始光谱经处理后的二阶导数光谱图见图2所示。

图1 天麻样品的NIRS原始光谱

图2 天麻样品的NIRS二阶导数光谱

1.6 近红外光谱数据处理

不同化学成分的近红外吸收主要与其化学结构有关，其吸收峰所含化学信息仅与某些特定波段关系密切。由于全波段光谱中不仅包含待测成分信息，还包含大量冗余信息，因此建模波段的准确选择对模型的建立十分关键。近红外光谱分析是从复杂、重叠、变动的背景中提取信息，在建立近红外校正模型时，对近红外光谱进行一系列预处理来放大信号，滤除噪音等处理，并选择合适的谱区及其他合适的参数。一般消除近红外光谱的旋转或者漂移造成的影响可以利用导数给与校正[13 ]。

采用TQ 8.6软件对采集的天麻样品光谱进行方差光谱分析，选取光谱方差较大的光谱段(7500～6900 cm-1和6100～4050 cm-1)作为天麻特征信息识别的原始变量，消除光谱的冗余信息，结果见图3所示。

图3 标准偏差选择特征光谱波段

2 结果与分析

2.1 校正模型建立

应用TQ Analyst 8.6光谱数据处理软件对样品的近红外漫反射光谱进行分析处理，将样品的近红外光谱分别与样品中素天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷、巴利森苷B的含量数据一一对应，采用偏最小二乘法(PLS)建立了测定天麻中4种成分的校正模型。4种成分的校正模型预测值与对应高效液相色谱法测定值之间的相关图见图4所示。

A.天麻素(gastrodin)B.对羟基苯甲醇(4-hydroxybenzyl alcohol)C.巴利森苷(parishin)D.巴利森苷B(parishin B)图4 NIR校正模型预测值与真实值之间相关图

用校正模型的相关系数R2、校正标准误差(SEC)和均方预测残差(SECV)对建模效果进行评价，相关系数R2越接近1则校正模型的预测准确性越高，天麻中4种成分的建模效果及校正模型参数如表2所示。由表2可知，天麻素、巴利森苷和巴利森苷B的近红外校正模型相关系数大于0.92，而对羟基苯甲醇的为0.8950，说明近红外光谱法测定具有相对较好的准确性。校正标准误差(SEC)和均方预测残差(SECV)的值越小，说明预测的误差越小，且两者的值越接近则表明模型过拟合的可能性越小。由表2可知，4种成分的近红外校正模型均不存在过拟合的风险，具有较好的稳定性。

表2 天麻中4种成分的NIRS校正模型参数

2.2 校正模型的外部验证

采用20个验证集样品分别对天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷和巴利森苷B的校正模型进行外部验证，4个成分的20个验证集样品的预测均方根误差(PMRE)分别为3.52%，5.27%，3.77%和3.81%。将20个验证集样品的模型预测结果与高效液相色谱法测定结果进行配对t检验(显著水平α=0.05)，结果表明两种测定方法的测定结果无显著差异。校正集模型参数和外部验证结果均表明所建立的天麻中天麻素、对羟基苯甲、巴利森苷和巴利森苷B的近红外模型具有预测稳定性和准确性。

2.3 校正模型的应用

用所建立的近红外预测模型对不同产地的待测天麻样品进行测定，结果见表3，从表中测定结果可知，中天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷和巴利森苷B这4种成分含量存在差异。

表3 不同产地天麻中4种成分的含量 (mg/g)

3 结论

本文采用近红外光谱(NIRS)技术结合偏最小二乘法(PLS)建立了同时定量测定天麻中天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷和巴利森苷B含量的快速检测方法，所建立的近红外光谱预测模型具有相关较好的预测稳定性和准确性，可用于天麻中天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷、巴利森苷B素含量的快速测定。