TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物高效液相色谱固定相研究*

李斗发，李亚楠，刘华林，字 敏

(云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500)

引言

在临床上使用的很多药品是手性药物[1]。不同的异构体具有不同的生理活性、物理和化学性质，有些药品一个对映体有药效，另一个对映体可能没有药效，甚至对人的身体健康有害[2]。所以，对具有手性的药物进行分离具有重大的现实意义。由于外消旋体的理化性质差别很小，很难把对映异构体分离开[3]，分离手性药物的方法很多，其中比较典型的有毛细管电色谱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)等[4-6]。手性固定相CSP(Chiral stationary phase，CSP)分离手性化合物是当前比较热门的研究方向，使用比较广的是多糖、环糊精和冠醚作为固定相[7-9]。

在过去的十多年里，研究员对共价有机骨架材料COFs(covalent organic frameworks，COFs)做了很多探索和研究，因为其具有很多优良的性能，例如，具有高的表面积、孔的体积、形状容易调节，方便组装[10]。COFs大量应用于气相色谱、液相色谱[11]、催化和识别等[12]领域。

本文使用后合成修饰法[13]和溶剂热合成法[14]，获得了具有手性的TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物，将其采用网包法[15-16]覆盖在球形硅胶上，用于制备手性固定相。实验结果表明TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物能够很好地分离手性药物、氨基酸以及位置异构体。与此同时，制备的手性固定相填充的分离柱具有较好的稳定性。通过研究表明，制备的手性CSP在分离手性化合物具有较大的潜能。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

D-Max-3B 2000X粉末衍射仪(日本，Rigaku公司)；S-3000N扫描电子显微镜(日本，Hitachi公司)；Chirascan圆二色光谱仪(英国，应用光学物理)；BRUKERTensor-27傅里叶红外变换红外光谱仪(德国，Bruker)；ASAP2020 氮气吸附仪(美国，Micromeritics公司)；EliteP230Ⅱ高压流压泵(大连依力特分析仪器有限公司)；EliteUV230Ⅱ 紫外检测仪(大连依力特分析仪器有限公司)；AT-330柱温箱(大连依力特分析仪器有限公司)；1666液相色谱装柱机(美国，Alltechi有限公司)；200 mm×φ4.6 mm 不锈钢高效液相色谱空柱(美国，Alltechi有限公司)；UniSil 5-100硅胶(苏州纳微科技股份公司)。

六亚甲基四胺(97%)、三氟乙酸(97%)、邻硝基苯胺(99%)、碘化钾(98%)、高碘酸钾(99%)、位置异构体(99%)均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三乙胺(≥99%)、二茂铁二氯化钯(99%)、均三甲苯(99%)、无水SnCl2(99%)均购于上海阿达玛斯试剂公司；氯化钠(≥99%)、葡萄糖(99%)购于天津市风船化学试剂科技有限公司；1，4二氧六环(98%)，外消旋化合物(99%)均购于美国Sigma-Aldrich有限公司；间苯三酚(98%)购于郑州阿尔法化工有限公司。

1.2 单体1，3，5-三甲醛间苯三酚(Tp)的合成

取用经干燥后的 7.549 g 六亚甲基四胺(54 mmol)，3.007 g 间苯三酚(24.5 mmol)，加入 500 mL 的三颈烧瓶中。对装置抽真空后充满N2，在N2的保护下，边搅拌边加入 90 mL 三氟乙酸，后将装置移入油浴锅，在 100 ℃ 下搅拌 3 h 后，取用配制好的 0.3 mol/L 的盐酸溶液 150 mL 加入到反应容器中，再反应 2.5 h。烧瓶取出冷却后，用二氯甲烷萃取产物，取有机相层，蒸发掉溶液后，用甲醇抽滤洗涤产物，得到单体1，3，5-三甲醛间苯三酚(Tp)，产物呈粉色。

1.3 单体3，3′-二硝基联苯胺(DNB)的合成

取 1.24 g 4-碘-2-硝基苯胺(5 mmol)，三乙胺 1.4 mL，0.016 g 二茂铁二氯化钯(DPPF，0.5 mmol)，17.5 mL 无水甲苯，依次加入到 100 mL 二颈烧瓶中，在90～130 ℃ 下搅拌反应 12 h，得到单体3，3′-二硝基联苯胺(DNB)，产物呈红色、粉末状。

1.4 TpBD(NH2)2的合成

称取 21.0 mg 的Tp(0.1 mmol)，41.1 mg 的DNB(0.15 mmol)，均三苯甲醛 0.75 mL，1，4-二氧六环 0.75 mL，3 mol/L 醋酸 0.5 mL，于Pyrex耐热玻璃管中，超声至其混合均匀。用液氮冷冻后，抽真空脱气，用酒精喷灯封管，在 120 ℃ 的条件下反应 72 h，待反应完成后，将玻璃管敲碎，取出产物，依次用丙酮、二氯甲烷洗涤，得到呈红棕色的产物。

取 3 g SnCl2·2H2O和 150 mg 上述合成的TpBD(NO2)2于 50 mL 的二颈烧瓶中，加入 5 mL 无水四氢呋喃使其混合溶解，在 50 ℃ 条件下加热回流 3 h。反应完成后，将沉淀物用 70 mL 的 1 mol/L 盐酸洗涤10次，用 70 mL 的水洗涤3次，并用 100 mL 丙酮洗涤一次。然后取上步产物于合适的反应釜中，加入 5 mL 苯甲醚，在 120 ℃ 烘箱内加热 24 h。最后，将粉末过滤并用 100 mL 丙酮洗涤。得到红棕色产物 TpBD(NH2)2，合成路线如图1。

图1 TpBD(NH2)2的合成路线

1.5 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的合成

称取 150 mg 上述合成的TpBD(NH2)2，1 g 干燥后的D-葡萄糖，20 mL 无水甲醇于 50 mL 的二颈烧瓶中，在 70 ℃ 条件下搅拌 4 d，待反应完成后，用纯水洗去未反应完的葡萄糖，烘干，得到红棕色的产物。合成路线如图2。

图2 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的合成路线

1.6 利用网包法制备TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物手性固定相

将TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物用玛瑙研钵研磨至比硅胶还细，称取 1.0 g 哌嗪于 50 mL 容量瓶内，加入异丙醇和 2 mL 三乙胺配制成 50 mL 溶液，称取 100 mg 研磨好的TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物加入到一定量配制好的上述溶液中，超声后浸泡上述硅胶3～ 4 h，吸出多余液体，在 110 ℃ 烘箱里加热处理 15 min，备用。

1.7 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物手性固定相色谱柱的填充

称取 4.2 g 制备好的固定相，用有机膜滤过的正己烷/异丙醇(体积比9∶1)为溶剂，用250目的筛子，将固定相用溶剂湿法过筛，待固定相沉降后，倒出上清液。采用高压匀浆法装柱，在装柱机的溶剂罐中加入约 800 mL 的上述溶剂，向过筛后的固定相加入约 40 m L的上述溶剂，倒入匀浆罐前，为保证固定相分散均匀，要搅拌后立即倒入。拧紧装置后，保持 35 MPa 5 min，后将压力调为 25 MPa 保持 30 min，结束后打开减压阀，取下色谱柱，装上柱头，贴上标签标识上下端，装到液相色谱仪器上，用正己烷/异丙醇(体积比9∶1)为流动相，0.5 mL/min 的流速冲洗色谱柱，待基线稳定即可测样。

1.8 色谱拆分条件和性能评价参数

用正己烷/异丙醇(体积比9∶1；8∶2)和甲醇/水(体积比9∶1；8∶2)作为流动相，流速为 0.5 mL/min，紫外检测波长分别为 254、210，220 nm，柱温为 25 ℃。

对色谱柱的分离效果用保留因子k，分离因子α和分离度Rs进行评价。公式分别为：

k1=(t1-t0)/t0

(1)

k2=(t2-t0)/t0

(2)

(3)

(4)

2 结果与讨论

2.1 1，3，5-三甲醛间苯三酚(Tp)和3，3′-二硝基联苯胺(DNB)的表征

对1，3，5-三甲醛间苯三酚(Tp)进行核磁共振氢谱表征。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：10.18(s，3H，CHO)，14.15(s，3H，OH)。对DNB进行核磁共振表征。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：7.1(d，J=8.9Hz，2H)，7.54(s，4H)，7.74(dd，J=2.3Hz，2H)，8.14(d，2H)。上述所得数据与文献报道[16]一致，表明已经成功合成Tp和DNB。

2.2 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物手性硅胶球的表征

2.2.1 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的粉末X衍射表征分析

据文献报道，TpBD(NO2)2的PXRD图案在对应于(100)面的3.5°处显示出强烈衍射，6.0°、9.4°和26°的反射分别归因于(110)、(210)和(001)平面，属于AA堆叠模式。由图3看出，在3.5°、6.0°、9.4°、26°均出现了衍射峰，与文献报道一致[1-3]，表明TpBD(NO2)2成功合成。经还原的TpBD(NO2)2和用D-葡萄糖修饰后的TpBD(NH2)2，其主要衍射峰也在3.5°、6.0°、9.4°、26°处，三者的峰形和出峰的位置基本相似，这也说明还原以及修饰后的物质的晶型和结构特征基本保持不变。

a.TpBD(NO2)2，b.TpBD(NH2)2，c.TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物

2.2.2 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的红外表征

TpBD(NO2)2、TpBD(NH2)2和TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的红外表征如图4所示，从图4(a)TpBD(NO2)2的红外图可以看出，TpBD(NO2)2在 1512 cm-1和 1362 cm-1有吸收峰，对应于-NO2的特征吸收峰。从图4(b)TpBD(NH2)2的红外图显示，对比图4(a)，在 1512 cm-1和 1362 cm-1处的峰强度减弱，说明TpBD(NO2)2中的-NO2被还原了。观察图4(c)在 1069 cm-1左右为C-O的特征吸收峰，对比图4(b)，强度有所增强，说明D-葡萄糖成功修饰了TpBD(NH2)2。

a.TpBD(NO2)2，b.TpBD(NH2)2，c.TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物

2.2.3 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物氮气吸附测试

为了进一步了解合成的D-葡萄糖衍生物的结构特征，我们对其进行了氮气吸附测试，结果见图5。使用Brunauer-Emmett-Teller(BET)方法对测量数据进行计算，得到TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的比表面积为 264 m2·g-1，孔体积为 1.78 cm3·g-1，通过Barrett-Joyner-Halenda(BHJ)分析计算测试数据，得到其平均孔径是 1.92 nm(图5b)，符合相关文献报道的参数。

图5 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的氮气吸附测试

2.2.4 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的圆二色谱分析

如图6所示通过D-葡萄糖修饰后的 TpBD(NH2)2显示出了Cotton效应，表明葡萄糖成功修饰在COF上，使衍生后的TpBD(NH2)2具有手性。

图6 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物圆二色谱图

2.2.5 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物的扫描电镜

为了观察采用网包法后，TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物有没有固载到硅胶上，分别通过扫描电镜对空硅胶和网包后的固定相进行观察，结果见图7。通过电镜图片可以观察到，没有经过网包的硅胶表面光滑，没有任何物质固载在其表面，而经过网包的硅胶，其表面固载了大量的经过研磨的TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物，说明通过网包法，所合成的手性COF材料已成功固载在硅胶表面。

(a)纯硅胶，(b)TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物固定相

2.3 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物手性固定相对于外消旋体的拆分

为了检测TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物制备的色谱柱的拆分能力，用其对外消旋体进行拆分。实验结果显示，所制备的手性色谱柱对15种手性物质能够进行不同程度的分离。其中CH3OH/H2O(体积比9∶1)的流动相对4种手性物质有一定的拆分效果，分别为二苯基乙醇酮、华法林、N-(3，5-二硝基苯甲酰)-L-亮氨酸、1-苯乙醇，而CH3(CH2)4CH3/(CH3)2CHOH的流动相对11种手性物质有一定的拆分效果，它们分别是2-甲基戊酸甲酯、2-乙基己酸、1，2-环氧丁烷、环氧溴丙烷、3-氯-2-丁酮、2-甲基戊醛、3-羟基丁酸乙酯、异丙基缩水甘油醚、乳酸乙酯、1-(1-萘基)乙胺、γ-辛内酯。它们的拆分结果见表1。

表1 色谱柱对15种手性物质的拆分结果

表1的分离结果显示，在CH3OH/H2O(体积比9∶1)的流动相条件下，所拆分的外消旋体中，二苯基乙醇酮和华法林做到了基线分离，拆分情况比较理想。在CH3(CH2)4CH3/(CH3)2CHOH的流动相条件下，2-乙基己酸、环氧溴丙烷、乳酸乙酯等达到了基线分离。两种流动相条件下，所拆分的物质不相同，能够相互补充，拓展了TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物手性固定相的拆分范围，该手性色谱柱所拆分的部分手性物质的谱图如图8所示。

图8 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物色谱柱对外消旋体的部分图谱

测试结果显示TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物对一些手性物质具有比较好的分离效果，有些甚至能达到基线分离。能够对手性物质进行拆分的原因是，COFs材料上被修饰了D-葡萄糖手性基团，使COFs材料具备了手性，手性COFs材料对两种对映异构体存在保留差异，从而能够对手性化合物进行拆分。除此之外，手性固定相和手性物质之间的各种作用力，可能也在某种程度上对这些物质的分离作出贡献。

2.4 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物液相色谱柱对于苯系位置异构体的拆分

为了探究TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物对于苯系位置异构体的分离情况，我们用所制备的色谱柱对苯系位置异构体进行了实验。在所分离开的这些物质中，该色谱柱对o，m，p-邻溴苯胺、o，m，p-硝基苯酚、o，m，p-氯苯酚能够进行一定程度的分离。它们的拆分结果见表2，拆分谱图见图9。

表2 色谱柱对2种位置异构体的拆分结果

图9 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物液相色谱柱对苯系位置异构体的部分色谱拆分图

从图9中可以观察到，因苯系位置异构体的分子结构存在一些差异，因此导致它们在经过色谱柱时，该固定相对它们的作用不同，使得它们随着流动相从色谱柱中流出的时间不相同，即彼此的保留时间有差别，这也正是它们能够被拆分的原因。从分离图谱可知，TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物色谱柱对3种苯系位置异构体都有一定的拆分效果，这也拓展了TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物手性固定相在物质分离方面的应用。

2.5 温度对TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物色谱柱的影响

为了研究不同温度对TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物色谱柱出峰情况的影响，选用华法林进行测试。探究了25、30、35、40、45 ℃ 五个检测温度对TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物手性固定相出峰效果的影响。从对比谱图(图10)中可见，随着温度的升高，其保留时间在逐渐往后移动。因此可知，在一定温度范围内，随着温度的升高，对色谱柱的出峰情况没有太大影响，只有保留时间在后移，不影响出峰情况。

图10 不同温度下华法林在TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物在色谱柱上的分离谱图.

2.6 TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物色谱柱的重复性

为了探讨TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物所制备的色谱柱的重复性，选择华法林为代表，重复测样5次，其拆分谱图如图11所示，经过计算，第一个峰的峰面积与保留时间的相对标准偏差(RSD)分别为1.34%和1.25%。这一结果表明，TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物所制备的色谱柱具有良好的重复性。

图11 华法林在TpBD(NH2)2的D-葡萄糖衍生物色谱柱上的重复性分离谱图

3 结论

本文通过查阅相关文献制备了COFs结构 TpBD(NH2)2，使用后合成修饰的方法，让葡萄糖修饰到了该材料上，通过“网包法”固载到球型硅胶表面，获得了高效液相色谱手性固定相。用该固定相对二苯基乙醇酮、华法林和N-(3,5-二硝基苯甲酰)-L-亮氨酸等15种手性物质进行了分离。研究结果表明，本文合成的手性材料能够使多种手性物质实现不同程度的分离。其中CH3OH/H2O(体积比9∶1)的流动相对4种手性物质起到一定的拆分作用，CH3(CH2)4CH3/(CH3)2CHOH(体积比9∶1)的流动相对11种手性物质有一定的拆分效果。这些结果证明，采用后合成修饰的策略，将手性基团连接到无手性的共价有机框架上是可行的，手性的COFs材料用于液相色谱固定相具有一定的前景。