细胞死亡机制在肝纤维化中的研究进展*

沈 炎 许文聪 代海洋 李 媛 黄古叶△

1.广西中医药大学 (广西 南宁, 530023) 2.广西中医药大学第一附属医院

肝纤维化是由多种病因导致的肝脏炎症反应进而引起的肝脏慢性损害,其关键点在于肝星状细胞(HSC)的活化及肝内细胞外基质(ECM)的过度增生和沉积,瘢痕组织的不断生成最终将发展成为肝硬化,甚至肝癌[1]。研究发现,肝纤维化是可逆的,细胞可以通过不同的死亡机制介导炎性小体或信号通路促进肝纤维化的发展[2]。因此,如何通过阻断细胞死亡通路从而逆转肝纤维化,成为目前研究热点。

1 细胞死亡机制

1.1 细胞焦亡 细胞焦亡,又称为细胞炎性坏死,是发生在机体的天然免疫反应,由半胱天冬酶1(caspase-1)诱导的经典通路及半胱天冬酶4/5/11(caspase-4/5/11)诱导的非经典通路组成。细胞焦亡是机体对病原微生物入侵采取的自体免疫保护反应,当过度发生时可导致细胞因子释放综合征(CRS)、败血症、严重炎症等。

焦亡经典通路由细菌、病毒等危险信号刺激,机体的病原相关分子模式(PAMP)和损伤相关分子模式(DAMP)触发,以先天免疫受体,即模式识别受体( PRR)作为感受器,通过炎性复合小体组装、介导去激活caspase-1前体(pro-caspase-1)。炎性小体是一种蛋白复合物,目前研究发现5个经典炎性小体(NLRP1、NLRP3、NLRC4、TPAF、AIM2),其中以NLRP3炎性小体研究最为深入[3]。NLRP3炎性小体作为靶点,募集后裂解pro-caspase-1,激活caspase-1。活化后的caspase-1作为P10～P20复合物的二聚体,一方面切割执行蛋白Gasdermin D(GSDMD)在N端和C端结构域的链接区,释放具有结合膜磷脂上膜打孔活性的N端结构域(GSDMD-NT),形成10～14 nm的孔道,造成渗透压改变,细胞内容物释放、水内流等使细胞破裂,引起炎症反应;另一方面刺激活化的caspase-1促进白细胞介素IL-1β、IL-18的分泌和激活,募集更多炎症细胞,扩大炎症反应[4-6]。

焦亡的非经典通路则是由脂多糖(LPS)等病原体刺激,使caspase-4/5/11活化后对GSDMD切割,释放具有膜穿孔活性的GSDMD-NT,使细胞膜破裂产生焦亡;同时诱导NLRP3激活caspase-1,进而激活IL-1β、IL-18,诱发焦亡;除此之外,细胞膜上的Pannexin-1通道与活化的caspase-4/5/11结合后可使P2X7受体通道打开,激活NLRP3释放促炎细胞因子,加速细胞焦亡[7,8]。不论经典途径还是非经典途径,GSDMD是触发细胞焦亡的关键[9]。因此,caspase-1和GSDMD是抑制焦亡的重要调控靶点,可阻止肝纤维化进展。

1.2 铁死亡 铁死亡是不同于焦亡的一类新的细胞死亡途径,不需要半胱天冬酶的参与和调控。铁死亡在细胞学上表现为细胞膜破裂,线粒体发生萎缩性改变,而细胞核仍保持完整形态;其实质是具有细胞膜毒性的脂质活性氧(ROS)堆积,细胞内氧化还原反应失衡[10]。调控铁死亡的途径主要有铁代谢途径、脂代谢途径和谷胱甘肽过氧化物酶4/谷胱甘肽(GPX4/GSH)途径等。

铁元素是人体必需的微量元素,多以正价铁离子(Fe3+)和二价亚铁离子(Fe2+)存在人体内。铁死亡中的铁代谢途径主要依靠于铁离子和亚铁离子的转换。Fe3+与转铁蛋白(Tf)结合,在转铁蛋白受体(TfR)的介导下,进入细胞内,一部分被细胞内的二价金属转运蛋白1(DMT1)还原生成Fe2+,形成铁池(LIP);另一部分储存在铁蛋白中,在核受体辅助因子4(NCOA4)的介导下发生铁自噬,释放游离铁离子,铁池中的Fe2+与过氧化氢(H2O2)产生芬顿反应,释放羧基自由基,促进脂质过氧化,产生大量脂质活性氧(ROS),破坏细胞膜结构,发生铁死亡[11,12]。另外,人体摄入的多不饱和脂肪酸(PUFA)可参与铁死亡的另一代谢途径——脂质代谢途径,PUFA在合成酶调控下,主要是乙酰辅酶A合成酶长链家族4(ACSL4)、溶血卵磷脂酰基转移酶3(LPCAT3)和脂肪氧合酶(LOX),生成有毒的磷脂氢过氧化物,最终导致脂质过氧化,造成细胞膜破坏[13]。而GPX4/GSH途径则是在胱氨酸谷氨酸转运受体(system XC-)的诱导下发生[14]。system Xc-是一种具有Na+依赖性的转运体,分为轻链xCT(SLC7A11)和重链CD98hc(SLC3A2),其中轻链SLC7A11对胱氨酸和谷氨酸的转运具有高度特异性[15]。Xc-系统以1∶1的比例将胱氨酸摄入、谷氨酸排出,还原成半胱氨酸,参与到谷胱甘肽(GSH)的合成中。合成后的谷胱甘肽作为GPX4的重要辅助因子,与GPX4协同作用,抑制脂质过氧化反应,阻止脂质活性氧的聚集。目前发现,system Xc-抑制诱导GSH耗损、GPX4的失活、抑癌基因P53、CoQ10的消耗、Erastin、ROS等均可诱导铁死亡[16,17]。

1.3 细胞凋亡 细胞凋亡是由细胞内外微环境扰动引起的。其特点是细胞皱缩、细胞膜起泡、核染色质浓缩、凋亡小体形成,不伴随细胞内容物的外泄和炎症反应的发生[18]。凋亡发生主要依靠两条途径：一是死亡受体引发的外源途径,二是线粒体引发的内源途径,且两条途径都与半胱天冬酶(caspase)的调控密切相关[19]。

凋亡的外源途径是自然杀伤细胞(NK)和巨噬细胞产生的死亡信号(FASL)与细胞膜上的死亡受体(FAS)结合,发生构象,将带有FAS相关死亡结构域的接头蛋白(FADD)募集至胞内的配体结构域上,死亡效应结构域(DED)募集caspase-8蛋白酶原,与FADD构象形成死亡诱导信号复合体(DISC),使caspase-8切割活化,激活下游caspase-3,诱导凋亡发生[20,21]。线粒体作为细胞内最大的能量转换器,内源性途径则是通过线粒体释放抗体实现。凋亡信号或者促生存信号出现,促凋亡蛋白Bax/Bak活化后发生寡聚化,线粒体外膜通透性发生改变,在B细胞淋巴瘤2(BCL-2)家族蛋白的调控下形成过渡孔[22],细胞色素C(Cyt-c)与基质中的凋亡蛋白酶活化因子1(APAF-1)结合,APAF-1暴露出的CARD结构域募集caspase-9蛋白酶原,caspase-9蛋白酶原在凋亡复合体中活化,进一步切割激活caspase-3,触发凋亡[8,23]。线粒体外膜通透性升高后还可释放促凋亡蛋白SMAC,SMAC结合凋亡蛋白酶抑制因子(IAP),解除对caspase酶的抑制,也可引发凋亡[24]。

2 细胞死亡在肝纤维化中的研究

2.1 细胞焦亡与肝纤维化的联系 肝脏作为最大的实质器官,主要由嗜酸粒细胞、肝星状细胞(HSC)、库普弗细胞及肝实质细胞等组成,而这些细胞均可发生焦亡,加速肝纤维化的进展。Palacios-Macapagal等[25]通过建立肝坏死细胞模型,并从血吸虫小鼠中分离出嗜酸粒细胞,发现坏死细胞可诱导嗜酸粒细胞分泌IL-1β、IL-18,从而证实了在细胞焦亡中,调节嗜酸粒细胞反应,可减少纤维化的产生。Meng等[26]和Inzaugarat等[5]研究发现,NLRP3作为Nod样受体家族pyrin结构域中的重要炎性小体,可以激活caspase-1,调控促炎细胞因子IL-1β、IL-18的分泌,活化肝星状细胞(HSC),转变成肌成纤维细胞,与肝脏炎症反应及纤维化的发生密切相关。值得注意的是,肝星状细胞还可由肝免疫细胞以NF-kB依赖性的方式激活,导致细胞外基质沉积[27]。而库普弗细胞(KC)作为肝免疫细胞,通过实验建模,注射炎性小体NLRP3抑制剂,结果发现,NLRP3在库普弗细胞中的表达明显高于肝星状细胞,且NF-kB受炎性小体NLRP3调节[28]。实验将IL-1受体拮抗剂处理NLRP3 CreZ敲入小鼠,经过细胞染色和免疫印迹分析等操作[29],发现NLRP3 CreZ小鼠肝实质细胞中的caspase-1和PI双阳性细胞数量明显增加,且活化的caspase-1增加了8倍。由此可知,肝实质细胞也可发生焦亡,引起纤维化改变。

2.2 铁死亡与肝纤维化的联系 铁死亡的实质在于有毒的脂质活性氧(ROS)的聚集,因此,清除ROS成为抑制铁死亡的关键。GPX4/GSH代谢途径作为铁死亡代谢途径之一,在清除ROS中发挥着巨大作用。GPX4作为抗氧化酶,过表达时可抑制脂质过氧化,影响L02细胞中ROS堆积,抑制铁死亡[30]。反之,则会加速死亡。Matsushita等[31]提出脂质过氧化可导致GPX4缺失的T细胞活化后死亡,并实验得出铁螯合剂和铁死亡抑制剂可消除T细胞死亡,延缓纤维化进展,证明了此过程涉及铁死亡,且GPX4缺失和纤维化的发展呈正相关。而胱氨酸谷氨酸转运受体(system XC-)是GPX4/GSH代谢途径中重要的调控靶点,若抑制system XC-,则可减少谷胱甘肽(GSH)合成,使ROS聚集,加速纤维化[32]。具体来说,铁死亡诱导剂Erastin可通过抑制XC-系统,加速还原型谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)的消耗,导致ROS堆积,增加纤维基因表达,诱导生成肌成纤维细胞[16,33]。另外,药物也可通过调节信号因子及通路调节ROS。Sui等[34]建立CCl4致大鼠肝纤维化模型,发现异甘草酸镁(MgIG)可降低肌成纤维标志物,如α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、胶原蛋白、纤连蛋白等的表达,还可调节TGF-β信号通路、PDGF-β信号通路、EGF信号通路及MMP/TIMP系统,清除ROS,抑制铁死亡,减轻CCl4导致的纤维化。Wang等[35]发现蒿甲醚(ART)可阻止ROS聚集,抑制铁死亡,一方面是调节TGF-β、PDGF-β和EGF信号通路直接作用于HCS;另一方面是抑制上游抑癌因子P53间接阻断HCS活化标志物表达,减轻CCl4诱导的肝细胞损害和肝纤维化。

2.3 细胞凋亡与肝纤维化的联系 细胞凋亡发生的过程中,线粒体膜通透性的改变及caspase酶的活化是加速凋亡、介导纤维化的重要环节,而这两个环节都与BCL-2蛋白的调控密不可分。Bax亚族作为BCL-2家族蛋白中的促凋亡蛋白,Bax/Bak使线粒体膜(MOM)通透化,cBid激活的Bax和BakΔC21形成大小随蛋白质浓度而改变的弹性蛋白渗透孔,使线粒体膜改变,诱发凋亡[22,36]。为了证实这一过程,An等[37]通过建立慢性肝毒素诱导纤维化模型,发现受损肝细胞线粒体可释放线粒体衍生危险信号(mito-DAPM),其主要活性成分是mtDNA,可与BCL-2家族蛋白产生一系列寡聚化反应,刺激线粒体膜通透性升高,激活肝星状细胞发生α-SMA上调、细胞增殖、促纤维化转录,导致瘢痕形成;同时还发现了巨噬细胞和Gr-1+髓细胞在抗纤维化中的重要作用。Caspase酶作为凋亡的另一重要靶点,它的激活需要BCL-2蛋白调控被释放的线粒体蛋白而实现,并进一步诱导凋亡发生[38,39]。有学者提出,丹参的水溶性提取物丹酚酸A(SA-A)可抑制纤维化,于是Wang等[40]建立CCl4诱导肝损害的动物实验,分别予不同剂量SA-A处理小鼠,发现高剂量的SA-A对肝脏细胞纤维化的抑制作用更明显,进一步免疫化学分析后得出,SA-A组中BCL-2蛋白表达增强,caspase酶表达减弱,印证了SA-A可通过调控BCL-2蛋白和caspase酶诱导凋亡,抑制肝脏纤维化。

3 总结与展望

在肝脏疾病的发展过程中,肝纤维化作为疾病发展的中间阶段,可由病毒性肝炎、药物性肝损害、酒精、血吸虫等多种病因导致。研究发现肝纤维化是可逆转的病理性过程,为防止疾病进一步进展成肝硬化、肝癌,逆转肝纤维化成为研究的重中之重。肝纤维化的产生与肝星状细胞的活化和瘢痕组织的累积密切相关,因此调控肝星状细胞的活化成为抑制肝纤维化的靶点[41]。大量研究表明,细胞可以通过不同的死亡机制诱导纤维化。如何调控相关信号通路,阻断细胞死亡对纤维化的影响,成为当代研究热点。调控细胞死亡靶点成为治疗肝纤维化的新思路。