食品微生物检验的方法及质量控制要点分析

耿 营

（东营市疾病预防控制中心，山东东营 257000）

人们的消费和健康观念逐渐发生改变，对食品安全问题也越来越重视。生产条件差异、监管力度不足等问题使食品质量参差不齐，食品安全问题时有发生，如毒酸奶、地沟油等[1]。食品微生物检测可帮助人们掌握食品中的微生物的含量与类型，了解食品加工环境及食品的卫生状况，判断食品的致病菌、毒素等有害成分的污染程度，为卫生管理、传染病控制、预防食物中毒等提供科学依据。

1 现存问题

虽然食品微生物检验技术不断发展，检验水平不断提高，但由于各种因素的影响，食品微生物检验仍然存在较多不足，影响检验结果的准确性。①检验人员专业水平参差不齐，在检验过程中存在采样不当、仪器操作失误、操作能力差、态度不认真和法律意识淡薄等问题，导致检验结果不准确。②不同食品检验方法存在差异，需要选择适宜的技术进行检验。随着新检验技术的推出，检验精度更高、检验特异性更强、检验灵敏度更好，采用新技术对提高食品微生物检验水平具有重要的意义，但受各种因素的影响，食品微生物检验中常存在新技术引进不足、推广受限的情况[2]。③食品微生物检验对环境要求高，通常需要干净无菌、温湿度适宜、空气质量达标的检验环境，但实际中常有实验室环境不达标的情况，影响食品微生物检验结果的准确性[3]。④在样品采样中，常出现采样随意、未按要求采样、样品采样操作错误和样品保存不当等情况，影响检验结果。

2 检验方法

2.1 传统检测法

传统检验法包括显微镜直接计数法、间接（活菌）计数法、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）检测法。显微镜直接计数法是将样品处理后放在显微镜下观察微生物的种类，并计数。间接（活菌）计数法是将样品稀释后再培养，培养基表面的一个菌落来源于样品的一个活菌，统计平板上的菌落数，计算样品的大概活菌数量，可以测定奶制品等食品中的细菌等微生物的含量。PCR 检测技术是将一段DNA 作为模板，在DNA 聚合酶和核苷酸底物作用下扩增该段DNA 至足够数量，进行结构和功能分析，可以对转基因大豆、玉米等农作物中的微生物进行定性、定量分析[4]。

2.2 分析化学技术

不同微生物的化学组成、代谢产物不同，可据此判断微生物的种类[5]。分析化学技术可用于碳水化合物、食品添加剂等检测，常用的方法有气相色谱法、气质联用技术、液质联用技术和高效液相色谱法。

2.3 免疫分析检测技术

免疫分析检测技术根据技术特点可以分为3 种。①免疫荧光技术需特异性荧光抗体与抗原标本反应，再干燥、封片、镜检即可。②免疫层析技术用化学法将小分子偶联到大分子上，固定到硝酸纤维素膜上后进行检测。③免疫磁珠分离技术是在样品中添加磁珠后混合，再添加高梯度磁场让磁珠与样品分离，移除样品，得到磁珠标记和未标记细胞组分。免疫分析检测技术常用于冷冻猪肉、牛奶等食品中沙门氏菌、大肠埃希菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌等微生物的检验。

2.4 生物传感器检测技术

生物传感器检测技术将生物受体复合物与物理化学传感器连接，用以观察并判断微生物的种类，如微生物传感器、免疫传感器、酶传感器和DNA 杂交传感器等，常用于肉类鲜度的评定和食品中大肠杆菌、沙门氏菌等微生物的检验。

2.5 分子生物学技术

①核酸探针技术利用碱基互补配对的原则进行检测，先用特异的基因探针与样品DNA 进行杂交，形成互补序列后检测目标DNA。②基因芯片技术是将基因探针固定在载体上，当溶液中的核酸序列与基因芯片上核酸探针产生互补配对时，可以获得一组与探针序列完全互补的序列，重组出靶核酸序列。③放射检验技术是标记培养基中碳源的碳，当使用培养基培养细菌时，会消耗碳，根据碳来确定样品中微生物的种类、数量，通常用于食品中的副溶血性弧菌、李斯特菌、沙门氏菌、霍乱弧菌和鸭疫中的默氏杆菌等致病菌的检测。

2.6 其他技术

①抗体检验技术中最常用的是酶联免疫吸附法。食品微生物检验可利用人工抗体与抗原发生反应，产生复合物，通过比色法测得结果，此法常用于检测食品样品中的金黄色葡萄球菌含量。②不同分子的导电性能存在差异，电导分析法可通过溶液导电率大小来测出某些微生物的含量，得出检测结果，食品检验中比较常用的是Mathus 系统。③商品化快速检验技术中ATP 生物发光法可以通过ATP 与荧光物质的结合进行细胞鉴定；染色成像计数法可以通过荧光过滤膜观察细胞颜色，判断细胞的活性，绿色细胞为死细胞，橙色细胞为存活细胞。

3 质量控制要点

食品微生物检验涉及的环节较多，任何一个环节存在纰漏或不足将直接影响检验质量。食品检验全步骤主要涉及检验人员、检验技术、环境和样品的采样及保存等，要确保食品检验质量，需要从这些方面入手。

3.1 检验人员

检验人员的综合素质直接影响检验质量，要对检验人员进行培训，培训内容包括基础理论、基本技能、质量标准、法律法规、检验新技术和质量管理等。基础理论培训可以巩固检验人员的理论知识；基本技能培训可以强化检验人员的操作水平；质量标准培训可以让检验人员熟悉各项操作要求，保证检验操作符合标准；法律法规培训可以让检验人员熟悉行业相关法律法规政策，提高法律风险意识；检验新技术培训可以让检验人员掌握新技术，不断提高检验技术水平。

3.2 检验技术

食品微生物检验方法众多，如显微镜直接计数法、PCR 检测技术、核酸探针技术、基因芯片技术和流式细胞技术等。不同方法的适用范围、准确度存在差异，检验人员需要熟悉各类检验技术的适用范围，在不同种类的食品检验中选择适宜的检验技术。例如，显微镜直接计数法适用于酵母菌、霉菌孢子等观察计数；PCR 检测技术方便快捷、成本低，但操作严格、易受污染、定量困难，在食品检验中适用于大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌和草鱼肠道细菌等检测；核酸探针技术特异性强、灵敏度高，但操作要求高、工作量大、成本高、不能检测毒素，在食品检验中适用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等检测；基因芯片技术灵敏度、特异度较高，但成本高、操作复杂，在食品检验中适用于肠出血性大肠埃希氏菌、志贺氏菌等检测；流式细胞术检测速度快、检测指标多，但容易受食品基质的影响，主要适用于益生菌检测、微生物活性检测、致病菌检测等。

3.3 环境

实验室环境要干净、无菌、温度适宜，避免杂菌生长形成污染影响检验结果[6]。实验室需限制闲杂人员进入，避免外界污染源进入室内；定期检测工作台、物品表面、空气中的病原菌含量，定期消毒；室内不可堆放杂物，以免形成消毒死角；每次实验前需要检查水浴锅、高压灭菌锅、培养箱和微生物限度检验仪等仪器设备的运行情况，确保仪器正常运行是保证检验质量的前提；每次检测结束后必须清洁工作台表面等，用专门的器皿装剩余培养基、杂物，防止形成污染源。

3.4 样品的采样和保存

不同的样品采样方法、保存方法、检验要求存在差异。在采样之前，采样人员要检查相关证件，准备好无菌的注射器、剪刀、铲子和样品袋等采样工具。采用随机采样方式，若样品被污染要第一时间重新采样。采样后，将样品装入专用容器中密封保存，保证样品从采样地点到实验室的过程中不被污染，贴好标签，记录采样时间、地点、人员。取样后，对于容易变质的样品，如畜肉、鱼类、乳制品和新鲜蔬菜瓜果等，要密封后低温冷藏保存，防止变质。检验人员要根据样品进行检验，贝类要在6 h 内检验，其他可在3 d 内进行检验，未进行检验的样品要做好储存，防止交叉感染、变质，冷冻的样品要防止融化。

3.5 仪器设备

食品微生物检验需要借助多种仪器设备，仪器设备的性能、精密度以及检验人员的仪器操作是否规范都会影响检验结果的准确性，做好仪器设备的管理是食品微生物检验质量控制的关键所在。仪器设备要定期做好维护工作，包括日维护、周维护、月维护等，记录维护情况，以保持仪器良好的性能，保障检验结果的准确性。在检验前，检验人员要检查仪器设备的性能、精密度，做好调试，确保仪器无异常。在检验过程中，检验人员要按照仪器设备的使用说明书规范使用仪器设备。例如，使用高压灭菌器灭菌时，加入的灭菌物要符合相关规定要求；培养箱中不可放入过冷、过热的物品，避免影响培养箱性能；冰箱要每天监测温度，温度浮动在1 ℃内，每季度检查消毒情况，确保平均菌落数＜103CFU·mL-1；干热灭菌箱要定期校准，每半年检查一次灭菌效果。

3.6 标准菌株的管理

标准菌株在食品微生物检验中起到与样本对照的作用，具有可追溯的遗传学特性，标准菌株的管理会直接影响检验结果的判读，影响检验结果的准确性和科学性。因此，标准菌株管理是食品微生物检验质量控制中的重要部分，标准菌株要通过正规途径购买，可以选择国内外认可的菌种保藏机构购买。购买后的菌株要按照要求进行管理，由技术负责人、微生物室负责人双人双锁管理，放在加锁的冰箱内，并做好标准菌株的分类存放。标准菌株要详细登记菌种名称、编号、数量、分离日期和动物致病力等信息，菌种传代要在5 代以内，防止交叉感染。定期检查标准菌株的活性，要做好不符合要求、失去活力的菌株的灭菌处理，防止污染，并需注明销毁原因及情况。传代后的菌株，要检查形态、菌落、毒性等，每移种3 次就需要做一次全面的鉴定，对于污染和变异的菌株，要做好灭菌处理。

4 结语

食品检验与食品安全息息相关，通过食品检验可以了解食品是否存在质量问题，食品微生物检验方法众多，不同检验方法的准确度、优缺点、适用范围等存在差异，需检验人员在检验时选择适宜的检验技术。加强对食品检验的质量控制对保障食品安全至关重要，需加强对检验人员、检验技术、环境、样品的采样及保存的管理，提高食品微生物检验质量。