玉米赤霉烯酮及其类似物残留检测技术研究进展

王博文，王 博

（河南科技学院，河南新乡 453003）

玉米赤霉烯酮是一种由镰刀菌产生的生物毒素，目前已知的类似物至少有15种，其中常见的有5种，包括α-玉米赤霉烯醇（α-Zearalenol，α-ZOL）、β-玉米赤霉烯醇（β-Zearalenol，β-ZOL）、α-玉米赤霉醇（α-Zeranol，α-ZAL）、β-玉米赤霉醇（β-Zearalenol，β-ZAL）和玉米赤霉酮（Zearalanone，ZAN），这些毒素主要污染农产品及其副产品，导致农产品的可用性下降。食用了高剂量的玉米赤霉烯酮谷物和饲料会使怀孕母畜出现流产、死胎、胎儿吸收等现象，甚至可能导致癌症[1]。因此，需要加大对玉米赤霉烯酮及其类似物检测方法的研究进度，以便能够准确检测食品中是否存在这种毒素，并进行精确测量，为饲料的安全提供保障，促进畜牧业的发展。

1 理化检测方法

玉米赤霉烯酮是一种天然白色结晶体，其分子式为C18H22O5，其中的烯酮基团决定了其雌激素活性，根据其理化性质，确定该类物质的传统理化检测方法主要包括高效液相色谱层析法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、薄层层析法等[2]。

1.1 高效液相色谱层析法

高效液相色谱层析法是目前检测食品中毒素残留量常用的方法，玉米赤霉烯酮及其类似物具有荧光特性，因此高效液相色谱层析法能够用于测定样品中的玉米赤霉烯酮及其类似物的残留量。高效液相色谱层析法通常包括提取样品、净化和浓缩样品、荧光检测以及外标法定量等步骤，该检测方法的样品加标回收率不低于88%，样品变异系数不超过4.0%；玉米赤霉烯酮及其类似物检测限在10～310 ng·kg-1[3]。尽管高效液相色谱层析法在检测食品中毒素残留量方面具有高灵敏度和高精度的优点，但其使用受到了设备和技术的限制，导致了成本较高、周期长和易产生交叉反应和假阳性等问题。由于对样品中待测成分的纯度要求较高，高效液相色谱层析法并不能满足大批量样品快速筛选的需要。

1.2 气相色谱法

气相色谱法是一种用于分离和分析混合物中化合物的分析技术。该技术将混合物中的化合物分离为单独的成分，然后使用检测器检测这些成分。气相色谱法检测玉米赤霉烯酮的优点是灵敏度高、精确度高、专属性强，但需要较长的分析时间，同时在操作过程中需要注意避免样品挥发和污染等问题。

1.3 气相色谱-质谱联用法

气相色谱-质谱联用法依据欧盟委员会标准2002/657/EC进行验证，已经用于动物体内激素类药物残留的检测，而且可以同时对多种激素和毒素进行检测。气相色谱-质谱联用法可以测定牛肌肉组织中玉米赤霉烯酮残留，该方法基于液-液萃取和固相萃取技术具有高灵敏度。然而，该方法需要高端设备和专业人员操作，操作过程烦琐且昂贵，对操作环境条件有严格要求，因此不适用于广泛使用。

1.4 薄层层析法

薄层层析法是在玻璃板上均匀地涂抹适宜的固定相（即吸附剂、支持剂和固化剂），制备出优质的薄层板，再将待测试样溶液点加在薄层板的一端，然后选用适合的溶剂将试样均匀展开，从而使试样成分分离，达到检测目的。国内外发布的检测标准要求均采用薄层色谱法。SCHAAFSMA等[4]采用薄层层析法对谷物中玉米赤霉烯酮的残留量进行了检测，该方法的检出限为200 ng·kg-1，回收率为84%，且排除了其他类似物的干扰，测定结果准确可靠。然而，由于薄层层析法需要使用多种辅助试剂和仪器，操作复杂，时间较长，特异性和灵敏度不高，误差较大，已无法满足现代饲料安全检测的要求，因此只在特殊情况下作为仲裁检验使用。

2 免疫学检测方法

免疫学检测方法主要包括酶联免疫吸附测定法、胶体金免疫层析法、免疫荧光技术、酶联免疫分析法等。

2.1 酶联免疫吸附测定法

酶联免疫吸附测定法适用于批量检测和普查，是一种准确度和灵敏度并重，快捷简便且检测成本低的检测方法，对检测人员的要求较低，被广泛用于检测各种物质。酶联免疫吸附检测法包括直接ELISA、间接ELISA、阻断ELISA、竞争抑制ELISA等。近年来，研究人员们开发了多种检测粮食中玉米赤霉烯酮残留的试剂盒。万宇平等[5]研发的ELISA试剂盒检测限为93.5 μg·kg-1，线性范围为50～405 μg·L-1，具有较好的稳定性和可靠性。王东等[6]研发的试剂盒的最低检出浓度为0.5 ng·mL-1，样品加标回收率不低于70.0%，并且可以用于检测玉米、小麦和高粱中的玉米赤霉烯酮残留量。这些试剂盒具有灵敏度高、稳定性好、加标回收率高等优点，可为饲料安全检测提供有力支持。

2.2 胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法是一种利用抗原和抗体结合反应的原理来检测目标物质的方法。它的工作原理是先将标记好的金标抗体固定在金标垫上，然后将待测样品加入，通过毛细效应使样品中的抗原与抗体产生特异性结合，最后通过胶体金标记显色来进行检测。王莹等[7]采用胶体金免疫层析技术研发出一种免疫胶体金试纸条，可以快速测定粮食和粮食产品中的玉米赤霉烯酮残留量，该试纸条的检测限为4.7 μg·kg-1，定量限为13.9 μg·kg-1，线性范围在14.5～500.0 μg·kg-1，相关系数为0.996 4。刘媛等[8]研发出一种用于快速检测动物尿液或水样本中玉米赤霉烯酮残留量的免疫胶体金试剂板，其检测阈值为2.5 μg·mL-1，整个检测过程只需10 min。这些试纸条和试剂板都是用于玉米赤霉烯酮残留快速检测的有效工具，相对于其他检测方法，胶体金免疫层析法具有特异性和灵敏性高、操作简便、成本低、结果能够长期保存等优点，其唯一的缺点是不能直接定量目标物质。因此，胶体金免疫层析法适用于现场操作和样本普查等应用场景。

2.3 免疫荧光技术

免疫荧光技术的主要原理是通过抗原抗体的特异性结合，使荧光素标记的抗原与细胞中的抗体特异性结合，以达到检测目的。该方法广泛应用于微生物检测，还可以使用单克隆抗体来鉴定淋巴细胞的亚类。此检测方法快速且灵敏度极高，交叉反应率较低，回收率平均值高于90%。

2.3.1 直接荧光法

该方法是利用抗原抗体特异性结合原理，结合切片染色法，然后通过荧光显微镜观察样品，有荧光出现则代表该样品内存在抗原。这种方法可以用于免疫细胞的检测。但是，该方法的缺点是不够灵便、快捷，步骤复杂烦琐。

2.3.2 间接荧光法

间接荧光法与直接荧光法相比，操作简单且具有更高的灵敏性。在间接荧光法中，第一抗体是不带荧光标记的，而第二抗体是带荧光标记的免疫球蛋白。第一抗体与待检测细胞上的抗原结合，再加入带荧光标记的抗免疫球蛋白抗体使之与第一抗体发生反应，最终观察荧光信号来确定抗原的存在，该方法对淋巴细胞亚类的检测十分有效。

2.4 酶联免疫分析法

该法吸附法和ELISA检测方法的原理非常相似。它们都利用固相表面标记抗原、抗原与抗体反应等原理，根据显色剂的深浅来判断检测结果。该技术通常使用酶标记二抗辣根过氧化物，这因为其具有可以较长时间保存，不易受到干扰的特性。

3 其他方法

3.1 噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是一种通过将合成的包被抗原与噬菌体抗体库相结合，再经过连续的负筛选、ELISA鉴定（酶联免疫吸附测定法）、克隆和SDSPAGE（电泳鉴定）分析等步骤，从而筛选出特异性玉米赤霉烯酮单链抗体的方法。这一技术的成功应用为后续制备特异性抗体提供了重要基础，为玉米赤霉烯酮的检测和研究提供了新思路和方法。其中，噬菌体展示技术的核心是将待筛选的抗原表面展示在噬菌体的表面，从而能够准确筛选出与抗原特异性结合的噬菌体。

3.2 时间分辨荧光免疫法

COOPER等[9]采用时间分辨荧光免疫法分析样品中的玉米赤霉烯酮残留量，与玉米赤霉烯酮试剂盒相比，时间分辨荧光免疫法可区分被镰刀腐霉菌污染的牛尿样品中的玉米赤霉烯酮的滥用，其检测阈值为0.16 μg·kg-1，此法准确性很高，可准确定量玉米赤霉烯酮的质量浓度在2～5 ng·mL-1，甚至在很多的镰刀腐霉菌属毒素共存时，也不受干扰，能够避免假阳性。

3.3 受体结合分析法

体内的受体蛋白可与样本中残留的同化激素产生特异性结合。STAN等[10]运用牛子宫细胞液中的雌激素受体与组织中残留的同化激素之间可产生特异性结合这一特性，对动物组织中包括玉米赤霉烯酮在内的7种不同雌激素类药物进行定性和定量测定，之后用气相色谱-质谱联用法进一步确证，得出检测限为1～5 μg·L-1，这种检测方法灵敏性高、特异性强并且结果可靠。

4 结语

玉米赤霉烯酮及其类似物是一种对动物健康有潜在危害的毒素，严重威胁着畜牧业发展，发展玉米赤霉烯酮及其类似物多残留快检技术成为当下食品安全检测领域的一项重要工作。当前，世界各国已经发展出了多种理化和免疫学检测方法，其中包括高效液相色谱层析法、薄层层析法、气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、免疫亲和柱-高效液相色谱法以及液谱和质谱联用法等。这些方法具有检测灵敏度高、准确度高、可靠性高等优点，可以有效地用于玉米赤霉烯酮的检测和定量分析。随着科学技术的不断进步和发展，玉米赤霉烯酮检测技术也会得到更多的突破和进展，从而更好地保障饲料安全和家畜家禽健康。