一种最小抑菌浓度检测试剂盒检测结核分枝杆菌临床菌株药物敏感性的效果评价

曹 滨,王 泉,于晋杰,邓乐乐,钱程宇,方丹昂,万康林,李马超,刘梦文,赵秀芹,赵丽丽,刘海灿,肖开提·米吉提,袁秀琴,李桂莲

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)感染引起的结核病是全球主要死亡原因之一,其中耐多药/利福平耐药结核病(multidrug-resistant or rifampicin-resistant tuberculosis,MDR/RR-TB)例数呈逐年上升态势[1]。一项关于中国耐药结核病的调查显示,5.7%的新病例为MDR-TB,是全球平均水平的两倍。因此,在中国开展快速、及时且准确的耐药性诊断对指导临床患者的治疗以及结核病防控意义重大[2]。目前,世界卫生组织(World Health Organization,WHO)推荐的体外药物敏感性试验方法为基于罗氏培养基的比例法,但该方法操作复杂、耗时长、检测药物浓度单一。因此,克服上述传统方法缺陷的基于液体培养基的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)检测法在临床体外药物敏感性检测领域中逐渐被推广使用,该法在缩短检测时限的同时,可一次性测定多种抗结核药物的最小抑菌浓度,并可通过定量确定菌株耐药程度以指导临床用药剂量[3]。

目前国内采用罗氏培养基比例法评价MYCOTB的研究较多,部分研究采用Bactec MGIT960快速药敏检测系统对其进行评价,然而以上对照评价方法均为二元药物敏感性分类法,即采用单一的药物临界浓度判读菌株对药物的敏感性[11-14]。而MYCOTB检测的是最小抑菌浓度,不仅可以判断药敏特性,还可以根据MIC值的高低判断菌株的耐药程度。目前缺乏评价MYCOTB检测MIC准确性方面的相关数据。因此,为正确评价MYCOTB检测药物敏感性以及MIC的效能,本研究将采用基于Middlebrook 7H9的常规微孔板微量肉汤稀释法对其进行验证,并采用全基因组测序技术对上述两种表型药敏试验耐药结果不一致的菌株作进一步验证。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2017年 1 月至2018 年 12 月期间来自新疆医科大学第八附属医院、喀什地区肺科医院、库车县传染病医院和乌什县人民医院确诊、登记且年满 16 周岁的结核病住院/门诊患者的临床分离MTB菌株847株并进行编号,采用系统抽样随机选取其中211株,经复苏传代成功并菌种鉴定为结核分枝杆菌的菌株共188株。MTB标准敏感菌株H37Rv(ATCC 27294)由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所保存和提供。

1.2 主要试剂及配制

1.2.2 常规微量肉汤稀释法试剂配制 11种抗生素的溶剂、药物储存液浓度、药敏板中最小及最大工作药物浓度及耐药临界值见表1。

表1 11种抗生素的配制及耐药临界浓度

1.3 药物敏感性试验

1.3.1 菌悬液制备 刮取培养2～3周的罗氏培养基上MTB培养物至生理盐水中,采用超声磨菌仪(体必康生物科技有限公司)制备成0.5或1麦氏浊度单位的菌悬液。

1.3.3 常规微孔板微量肉汤稀释法 本研究所用的药物储存液均为新鲜配制,分装储存于-80 ℃冰箱,使用前室温融化。所有药物储存液储存时间小于2个月。在96孔板的第1列中,将药物储存液用7H9肉汤培养基(含10% OADC生长添加剂)稀释至最大工作浓度后,在第1～12列间进行倍比稀释,使每孔含100 μL含药培养基。每株菌株每个微孔板均设置一行不含药液的阳性对照。将1麦氏浊度单位的菌悬液用7H9肉汤培养基(含10% OADC生长添加剂)进行20倍稀释,以100 μL/孔加入到含药液的96孔板中。用黏性贴膜密封96孔板后置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养14 d[8,18]。结果观察和MIC定义同MYCOTB。因多项研究已证实MYCOTB检测环丝氨酸结果不可靠[19-20],因此,本法仅检测除环丝氨酸以外的其余11种药物。

1.3.4 全基因组测序 对MYCOTB和常规微孔板微量肉汤稀释法检测结果不一致的菌株采用全基因组测序技术进行验证。采用CTAB/NaCl法提取MTB全基因组,利用Nanodrop ND-1000核酸分析仪测定核酸样本的浓度及纯度,合格样本采用MGISEQ-2000测序仪(深圳华大基因科技服务有限公司)进行2×150 bp双末端、500×测序。完成测序后使用SOAPnuke及FastQC对原始FASTQ序列进行过滤。选取Reads测序深度超过400×,基因组覆盖度超过90%的样本用TB-profiler软件进行耐药相关基因突变状况分析。INH的耐药相关基因为katG和inhA;RFP与RFB的耐药相关基因为rpoB;EMB的耐药相关基因为embB、embA和embC;SM的耐药相关基因为rpsL、rrs和gidB;氟喹诺酮类药物(Mfx,Ofx)的耐药相关基因为gyrA和gyrB;AMK和KM的耐药相关基因为rrs和eis;PAS的耐药相关基因为thyA和drfA;ETH的耐药相关基因为ethA、ethR和inhA[21-23]。

1.3.5 质量控制 质控菌株为MTB标准株H37Rv(ATCC 27294),该菌株对多种抗结核药物均敏感。每块MYCOTB药敏板均含有两个阳性对照孔(不含抗结核药物),当阳性对照孔中均存在可见的或可接受的细菌生长,且某种药对应的孔中没有污染、蒸发和跳孔现象时,则MIC结果认为是可读且有效的。每批MYCOTB药敏板均取一块板子采用H37Rv评价其有效性。由2名实验员分别通过VizionTM数字观察系统盲法读取结果,对结果进行复核。

1.4 数据分析 应用SPSS 11.0软件进行统计分析。以常规微量肉汤稀释法检测结果为金标准,计算MYCOTB检测药物耐药性的灵敏度、特异度和符合率。采用Kappa检验检测两种方法的一致性,Kappa值≤0.4说明一致性较差,0.4～0.75说明一致性较好,≥0.75说明一致性很好。MYCOTB与常规微量肉汤稀释法关于不同药物MIC分布结果的比较采用双侧秩和检验,P<0.05为差异有统计学意义。MIC结果分布图采用R 3.6.3软件。

2 结 果

2.1 两种表型药敏试验检测结核分枝杆菌临床分离菌株对11种抗结核药物耐药性的比较 以常规微孔板微量肉汤稀释法为金标准,MYCOTB对11种抗结核药物耐药性诊断的敏感性、特异性和一致性情况见表2。MYCOTB检测RFP耐药性的敏感度最高,为92.0%;检测ETH、RFB、SM和INH耐药性的灵敏度均大于80%;检测PAS、OFX、AMK、MFX、EMB 和KM 6种药物耐药性的灵敏度均不足80.0%,而检测KM耐药性的灵敏度最低,仅为40.0%。MYCOTB 法检测11种药物耐药性的特异度均大于90.0%。

表2 MYCOTB检测结核分枝杆菌对11种抗结核药物耐药性的效能分析

11种药物中,对AMK、KM、RFP、ETH、SM、PAS、RFB、EMB和OFX 9种药物耐药性的诊断,两种方法的符合率均≥91%,其中AMK最高,为97.9%;INH的符合率次之,为87.2%;MFX的符合率最低,为85.7%。采用Kappa检验进一步验证,发现两种方法中RFP、KM、EMB、ETH、RFB和INH 6种药物的一致性良好,Kappa值均≥0.75,其中RFP最高,为0.89;OFX、AMK、SM、PAS和MFX 5种药物的一致性较好,Kappa值为0.4～0.75,其中MFX最低,仅为0.47。对于各种药物,两种检测方法耐药结果不一致的菌株数见表2,本研究将对这些菌株进行全基因组测序验证。

2.2 两种表型药敏试验检测11种抗结核药物MIC值分布的比较 两种方法检测11种药物的MIC值结果分布见图1,其中部分药物的MIC值分布存在差异,如AMK、ETH、OFX和PAS这4种药物的MIC分布差异较大(AMK,W=32 001.5,P=0.002;ETH,W=29 890.0,P=0.001;OFX,W=27 391.0,P<0.000 1;PAS,W=28 187.0,P<0.000 1),其中AMK的MIC值差异范围主要集中在0.5～1 μg/mL之间,ETH的MIC值差异主要为1.2～2.5 μg/mL,而OFX和PAS的MIC值分布表现为低于和高于耐药临界值区域的差异。总体而言,对于AMK、ETH、OFX、PAS这4种药物,MYCOTB法测得的MIC值高于常规微量肉汤稀释法,但对耐药结果的判断未产生明显影响。

注:Middlebrook表示常规微孔板微量肉汤稀释法;ns:P>0.05;*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001;****:P<0.000 1。

与常规微孔板微量肉汤稀释法相比,MYCOTB测得PAS、OFX、AMK、MFX、EMB 和KM这6种药物耐药性的灵敏度不足80.0%。因此,本研究对两种方法耐药株的MIC值分布范围进行了比较。常规微孔板微量肉汤稀释法和MYCOTB分别检测出8株和14株耐PAS菌株,MIC值范围分别集中于32～64 μg/mL和4～16 μg/mL;分别检出34株和29株OFX耐药菌株,MIC值范围分别集中于2～8 μg/mL和8～32 μg/mL;分别检出7株和5株耐AMK菌株,由于耐药菌株数量较少,MIC值分布无明显集中趋势;分别检出30株和31株MFX耐药菌株,MIC值范围分别集中于1～8 μg/mL和1～2 μg/mL;分别检出23株和19株EMB耐药菌株,MIC值范围分别集中于4～16 μg/mL和8～16 μg/mL;分别检出10株和4株KM耐药菌株,常规法的MIC值范围为20～40 μg/mL,而MYCOTB由于耐药菌株数量较少,MIC值分布无明显集中趋势。

2.3 MYCOTB检测耐药而常规微孔板微量肉汤稀释法敏感的菌株耐药相关基因测序结果 如表3所示,11种药物中,仅KM未出现MYCOTB耐药但常规法敏感的菌株,其他仅MYCOTB耐药的菌株中SM、AMK、RFB、RFP、OFX、ETH、EMB、INH、MFX和PAS耐药株的突变比例依次为4/4、1/1、5/6、3/4、4/6、3/5、3/6、5/10、6/14和0/8。仅MFX和PAS耐药株的突变比例未达半数以上。共有53.1%(34/64)的菌株发生耐药基因的突变。

表3 MYCOTB检测耐药而常规微孔板微量肉汤稀释法敏感的菌株耐药相关基因测序结果

2.4 MYCOTB检测敏感而常规微孔板微量肉汤稀释法耐药的菌株耐药相关基因测序结果 如表4所示,仅常规法耐药的ETH、RFB、SM、EMB、AMK、MFX、KM、OFX、INH、RFP和PAS耐药株的突变比例依次为4/4、4/4、5/6、6/10、1/3、4/13、1/6、1/11、2/14、0/4 和0/2,仅4种药物的耐药株突变比例占半数以上。具体突变情况见表4。共有36.4% (28/77)的菌株发生耐药基因的突变。

表4 MYCOTB检测敏感而常规微孔板微量肉汤稀释法检测耐药的菌株耐药相关基因测序结果

2.5 MYCOTB检测结果双人盲法判读符合率 对188株菌株的11种药物以耐药或敏感性进行分类判读,总符合率为93.5% (1 933/2 068)。不同药物的双人符合率见表5,符合率最大为异烟肼98.4%(185/188),最小为MFX和PAS,均为90.4%(170/188)。

表5 MYCOTB检测不同药物耐药性结果的双人盲法判读符合率

3 讨 论

目前已有多项采用基于罗氏培养基或7H10 固体培养基的比例法作为比较方法,评估MYCOTB检测结核分枝杆菌临床菌株药物敏感性的效果。但由于检测原理和方法的差异,方法学的可比性不强,结果未能显示其真实性。而且,研究表明MTB在固体培养基上的生长速度相对缓慢,耐药突变株与野生型菌株生长速度也存在差异,导致微量液体法检测为耐药的菌株,基于固体培养基的方法可能报告为敏感[24-25]。此外,目前缺乏评价MYCOTB检测MIC准确性方面的相关数据。因此,本研究采用同种培养介质和原理的常规微孔板微量肉汤稀释法做参照,评价MYCOTB的检测效能具有重要的意义。综合常规微孔板微量肉汤稀释法和全基因组测序法结果,显示MYCOTB检测MTB对11种药物的敏感性具有良好效果,5种药物耐药性的灵敏度达80%以上,11种药物的特异度均大于90%。

常规微孔板微量肉汤稀释法使用新制备的药物稀释液,虽可以根据需求定制药物,但要求提前配制药物储备液,后续还需倍比稀释药物,而且需要人工接种菌液,对操作人员技术要求高、工作量大,这些缺陷限制了常规微量肉汤稀释法的推广应用。与之相比,商品化的MYCOTB具有以下优势,主要表现为:①药物粉末提前包被于药敏板,避免了药物稀释过程中的误差,使药物稀释梯度更加准确,减少实验室人员工作量;②使用自动加样系统,减少实验室人员工作量;③药物粉末提前包被于微孔板中,利于实验室间药敏结果的比较。此外,对比使用7H9液体培养基的MYCOTB与使用基于罗氏培养基和/或7H10的固体培养基的检测结果报告时间的差异,发现前者能缩短至少一半的时间,这表明包括MYCOTB在内的肉汤微量稀释法具有良好的应用前景和技术上的优势[12]。随着分子生物技术的发展,耐药相关基因的突变是MTB产生耐药的主要机制已成为共识。因此,利用全基因组测序技术检测耐药相关基因是否突变对判断临床菌株是否耐药具有重要参考意义[26]。本研究结合常规微孔板微量肉汤稀释法和基因组测序技术,证明MYCOTB检测11种药物的耐药性效果良好。

EMB是敏感型结核病治疗方案的主要药物及MDR/RR-TB治疗方案的备选药物之一,因此对EMB耐药与否的判断将很大程度影响治疗方案的制定。本研究结果表明,对比MYCOTB与常规微孔板微量肉汤稀释法对4种一线抗结核药物耐药性的检测效果,其中符合率最低的是EMB(为91.5%),高于另两项比较MYCOTB与基于7H10固体培养基的比例法的研究结果,其符合率分别为79.7%[12]和77.6%[13],这可能与本研究采用同种培养介质致检测结果符合率较高有关,这提示采用不同培养介质的药物敏感性试验方法会影响结果的判断。然而,本研究检测的样本量较小,尚不足以说明EMB耐药性的实际情况。此外,本研究还发现OFX和MFX这2种喹诺酮类药物的符合率分别为91.0%和85.7%,这与Lee J等基于Middlebrook 7H10琼脂比例法的MYCOTB对OFX(94.1%)和MFX(84.7%)的符合率结果类似[12],表明MYCOTB对这2种药物敏感性检测效果相对稳定。

以常规微孔板微量肉汤稀释法为参照,MYCOTB检测11种药物耐药性的特异度均≥90%;但对于KM,其敏感度仅为40%,可能与耐药菌株数量较少有关(KM耐药株常规微量肉汤稀释法为10株,MYCOTB仅为4株)。比较2种方法对11种药物的MIC值分布差异,结果发现在敏感株中MYCOTB测得MIC值整体高于常规微量肉汤稀释法(图1),可能是检测浓度较低时,MYCOTB孔中药物量小、不稳定所致。虽然AMK、ETH、OFX和PAS 4种药物的MIC值整体分布存在差异,但对于以检测MTB菌株耐药或敏感为目的的二元分类结果的判定未产生明显影响。

本研究检测的11种药物中,除了KM外,均存在MYCOTB或常规微孔板微量肉汤稀释法单独诊断耐药的菌株,且均有部分菌株经全基因组测序技术证实存在耐药相关基因的突变,表明尽管2种方法均为液体培养基,但均存在耐药检测结果不稳定的情况,可能是由于MYCOTB的药物粉末以干粉形式提前固定于板中,各种药物需要不同的溶剂且各药物稳定性有差异,而常规微孔板微量肉汤稀释法从药物储备液制备到梯度稀释都可能造成药物浓度的误差,最终影响实验结果。本研究对于常规微量肉汤稀释法和MYCOTB这2种方法检测结果不一致的菌株进行测序验证发现,MYCOTB法耐药而常规微量肉汤稀释法敏感的菌株突变率(53.1%)高于常规微量肉汤稀释法耐药而MYCOTB法敏感的菌株(36.4%),且有8种药物(SM、AMK、RFB、RFP、OFX、ETH、EMB和INH)在仅MYCOTB检测为耐药的菌株中存在半数以上菌株检测出耐药相关基因的突变,和仅常规微孔板微量肉汤稀释法检测耐药株中仅4种药物(ETH、RFB、SM和EMB)存在这样的现象,表明MYCOTB可能对耐药菌株的识别更为准确,提示联合快速分子诊断并辅以相较于传统药敏更高效安全的MYCOTB将有效提高临床诊断效率,同时,由于本研究采用的常规微孔板微量肉汤稀释法中,接种的菌液高于MYCOTB法(7.5×106CFU/mLvs.1.5×106CFU/mL),这可能也是仅常规微孔板微量肉汤稀释法检测耐药株中突变比例较低的原因。

综上所述,本研究结果表明,MYCOTB是一种可靠的MTB药敏试验工具,其推广应用可指导临床医生为患者选择治疗药物提供依据。但MYCOTB仅可检测12种冻干的一线和二线抗结核药物,未完全包含MDR/RR-TB治疗用的A组和B组中的重要药物,因此,无法界定更新的广泛耐药结核病。因此,未来有必要对药敏板中的药物种类进行调整或开发新的药敏板。

(对提供菌株的新疆医科大学第八附属医院、喀什地区肺科医院、库车县传染病医院和乌什县人民医院的老师们深表感谢!)

利益冲突：无

引用本文格式：曹滨,王泉,于晋杰,等.一种最小抑菌浓度检测试剂盒检测结核分枝杆菌临床菌株药物敏感性的效果评价[J].中国人兽共患病学报,2023,39(9):827-836.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.097