基于网络药理学的丹白颗粒治疗盆腔炎性疾病作用机制研究Δ

翟弋焱,陈美琳,王 伟,时 锐,黄佳奇,张景媛,张繁芹,吴嘉瑞#

(1.北京中医药大学中药学院,北京 100029; 2.鲁南制药集团股份有限公司中药共性技术国家重点实验室,山东 临沂 276000)

盆腔炎性疾病(pelvic inflammatory disease,PID)是女性内生殖器及其周围结缔组织、盆腔腹膜发生的炎症病变,该病是一类妇科常见病,主要包括盆腔腹膜炎、子宫内膜炎和输卵管炎等[1]。PID具有发病率高、病程长和病情反复等特点。相关研究结果表明,在一些发展中国家PID的发病率高达40%,严重影响了女性的身心健康,降低其生活质量[2]。倘若未能及时治疗,则可能引起PID后遗症或并发症。PID后遗症过去多称为慢性盆腔炎,美国疾病预防控制中心(CDC)认为慢性盆腔炎实际上又是一次新的盆腔炎发作。多数学者及文献中也已摒弃了这个术语,改为PID的后遗症(SPID)[3]。根据临床诊断,SPID大致分为近期与远期2种,近期包括输卵管卵巢脓肿、肝周围炎等,甚至可以导致死亡;远期后遗症包括不孕症、慢性盆腔结缔组织炎、异位妊娠和PID反复发作等[4-5]。

西医对PID的治疗采用抗菌药物、手术治疗和理疗(激光疗法、微波疗法)为主。在治疗中,一方面普遍存在抗菌药物滥用的情况,使患者承担药品不良反应和昂贵的医疗费用;另一方面,治疗疗程较短,容易造成PID反复发作[6]。由于PID急性期的临床表现多以发热、腹痛和带下为主,SPID的临床表现多以带下过多、月经失调和不孕症为主,与中医古籍中论述的“癥瘕”“妇人腹痛”“带下”“痛经”和“月经不调”等病证相似。中医认为,PID发病是由于经期、产后,妇女正气虚弱造成湿热邪毒内侵,正邪交锋导致气滞血瘀、湿热壅盛、热毒炽盛[7]。丹白颗粒是由红藤败酱汤和四物汤加减而成的中成药颗粒制剂,主要针对PID瘀热湿阻的发病机制,其由牡丹皮、大血藤、紫花地丁、三棱、莪术、败酱草、川芎、白花蛇舌草、白英、土茯苓、墓头回、椿皮、白芍和当归14味中药组成,在临床常被用于治疗PID,但具体作用机制尚不明确,值得深入研究[8]。本研究主要使用网络药理学结合分子对接的方法对丹白颗粒治疗PID的机制进行探索。

1 资料与方法

1.1 丹白颗粒活性成分的筛选与靶点预测

在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP, http: //tcmspw.com/)中,以“牡丹皮”“大血藤”“紫花地丁”“三棱”“莪术”“败酱草”“川芎”“白花蛇舌草”“白英”“土茯苓”“墓头回”“椿皮”“白芍”和“当归”为关键词检索化学成分。设置口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18,检索中国知网、PubMed等数据库,查询丹白颗粒化学成分研究相关的文献。最后结合二者结果使用Uniprot(https://www.uniprot.org/)数据库查询靶蛋白所对应的基因名[9]。

1.2 PID相关靶点的筛选

使用DisGeNET与GeneCards数据库,以关键词“pelvic inflammatory disease”or“Sequelae of Pelvic Inflammatory Disease”检索获得盆腔炎相关基因,合并2个数据库的结果为PID的相关靶点。

1.3 丹白颗粒化学成分-靶点网络图的构建

使用Cytoscape 3.8.2软件构建丹白颗粒化学成分与靶点的网络图。根据介数、紧密度和度值等参数筛选关键靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络图的构建与模块分析

对药物靶点与疾病的靶点取交集,使用STRING(https://cn.string-db.org/)数据库分析得到PPI网络,将网络分析结果使用Cytoscape软件可视化,使用MCODE插件进行模块分析。

1.5 基因本体(GO)功能富集分析与京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

使用R软件对PPI网络中的基因进行GO与KEGG分析。

1.6 分子对接

根据预测网络结果找寻其相对应的化合物,从PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中获得化合物的SDF格式文件,通过RCSB PDB(https://www.rcsb.org/)数据库筛选获得蛋白质结构。最后使用Autodock Vina 1.1.2进行运算对接。整理分析对接结果,根据结合能进行升序排列,使用PyMol 2.3.2软件进行可视化处理。

2 结果

2.1 成分-靶点网络图

成分靶点网络图包括460个节点,2 363条边,其中70个化合物与377个靶点相关联,见图1。

2.2 潜在靶点的PPI网络图

对化合物与疾病靶点取交集得到240个交集靶点,绘制韦恩图,见图2。将交集靶点导入STRING网站进行分析,使用Cytoscape软件可视化PPI网络图,图中有198个节点,1 159条边,见图3。使用MCODE功能进行模块分析,见图4。得分高的模块意味着其中的靶点关系更密切,可能共同参与某种生物途径。

2.3 GO功能富集与KEGG通路富集分析

对PPI网络进行GO与KEGG富集分析。PPI网络的分析得到186条KEGG通路和3 730条GO功能条目。在GO条目中包括3 324条生物过程相关条目、166条细胞成分和240条分子功能相关条目。P值最低的10条通路为癌症通路、脂质与动脉粥样硬化通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信号通路、人巨细胞病毒感染、乙型肝炎、癌症中的蛋白多糖、卡波西肉瘤相关性疱疹病毒感染、化学致癌-受体激活信号通路、前列腺癌及血流剪切应力与动脉粥样硬化,见图5—6。

菱形代表化合物的靶点;正六边形代表药物;圆形代表药物的化学成分;A—H代表药物的共有成分the rhombus represents the target of the compound; the hexagon represents the drug; the circle represents the chemical composition of the drug; and the A to H represents the common composition of the drug图1 丹白颗粒的成分-靶点网络图Fig 1 Components-target network diagram of Danbai granules

图2 丹白颗粒与PID的交集靶点图Fig 2 Intersection target map of Danbai granules and pelvic inflammatory disease

每个节点的大小代表了其度值,颜色由浅到深代表了紧密中心由大到小the size of each node represents its degree value, and the color from light to dark represents the tight center from large to small图3 丹白颗粒相关靶点PPI网络图Fig 3 PPI network diagram of related targets of Danbai granules

A.模块一(score: 6.692);B.模块二(score: 4.444);C.模块三(score: 4.375)A. module 1 (score: 6.692); B. module 2 (score: 4.444); C. module 3 (score: 4.375)图4 丹白颗粒治疗类风湿性关节炎的PPI网络模块Fig 4 PPI network module of Danbai granules in the treatment of rheumatoid arthritis

2.4 药物-成分-靶点-通路网络图

对网络进行参数筛选得到关键基因,分别为磷脂酰肌醇3激酶催化亚单位α异构体(PIK3CA)、肉瘤基因(SRC)、肿瘤蛋白53(TP53)、热休克蛋白90α(HSP90AA)、蛋白激酶B1(Akt1)、丝裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、雌激素受体1(ESR1)、表皮生长因子受体(EGFR)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、v-rel 网状内皮细胞过多症病毒癌基因同源物A(RELA)和白细胞介素6(IL-6)。对部分分析结果进行展示(见图7),得到药物-成分-靶点-通路网络图(见图8)。

2.5 分子对接

使用AutoDockTools 1.5.6 软件对关键靶点及其相对应的化合物进行分子对接。将部分对接结果进行可视化,见图9。一般来说,结合能越小,配体化合物与受体蛋白的结合效果越好。

图5 丹白颗粒治疗PID的PPI网络模块GO和KEGG富集分析结果Fig 5 Results of GO and KEGG enrichment analysis of Danbai granules in the treatment of PID PPI network module

图6 丹白颗粒治疗PID的PPI网络GO和KEGG富集分析结果Fig 6 Results of GO and KEGG enrichment analysis of Danbai granules in the treatment of PID PPI network

五角星代表丹白颗粒的作用位点the pentagram represents the check point of Danbai granules图7 丹白颗粒作用于PI3K-Akt信号通路示意图Fig 7 Schematic diagram of Danbai granules acting on PI3K-Akt signaling pathway

椭圆形代表药物,菱形代表关键化合物,V形代表关键靶点,矩形代表通路;hsa05167(卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染),hsa05161(乙肝通路),hsa05205(癌症中的蛋白多糖),hsa05163(人巨细胞病毒感染),hsa05417(脂质与动脉粥样硬化信号通路),hsa04668(TNF信号通路),hsa04625(C型凝集素受体信号通路信号通路),hsa05135(耶尔森氏菌感染信号通路),hsa05152(肺结核信号通路),hsa05166(人T细胞白血病病毒1型感染信号通路)oval represents drugs, rhombus represents key compounds, V represents key targets, and rectangles represent pathways. Hsa05167 (Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection), hsa05161 (hepatitis B pathway), hsa05205 (proteoglycans in cancer), hsa05163 (human cytomegalovirus infection), hsa05417 (lipids and atherosclerosis signaling pathway), hsa04668 (TNF signaling pathway), hsa04625 (C-type lectin receptor signaling pathway signaling pathway), hsa05135 (Yersinia infection signaling pathway), hsa05152 (pulmonary tuberculosis signaling pathway), hsa05166 (human T-cell leukemia virus type 1 infection signaling pathway)图8 药物-成分-靶点-通路网络图Fig 8 Drug-component-target-pathway network diagram

A.木犀草素作用于IL-6(结合能:-35.15 kJ/mol);B.槲皮素作用于Akt1(结合能:-26.36 kJ/mol);C.槲皮素作用于IL-6(结合能:-33.89 kJ/mol);D.木犀草素作用于TNF-α(结合能:-30.12 kJ/mol);E.槲皮素作用于TNF-α(结合能:-29.71 kJ/mol);F.槲皮素作用于MAPK1(结合能:-35.98 kJ/mol);G.柚皮素作用于ESR1(结合能:-36.82 kJ/mol);H.木犀草素作用于RELA(结合能:-38.49 kJ/mol)A. luteolin act on IL6 (affinity: -35.15 kJ/mol); B. quercetin on Akt1 (affinity: -26.36 kJ/mol); C. quercetin act on IL6 (affinity: -33.89 kJ/mol); D. luteolin act on TNF-α (affinity: -30.12 kJ/mol); E. quercetin act on TNF-α (affinity: -29.71 kJ/mol); F. quercetin act on MAPK1 (affinity: -35.98 kJ/mol); G. naringenin act on ESR1 (affinity: -36.82 kJ/mol); H. luteolin act on RELA (affinity: -38.49 kJ/mol)图9 分子对接Fig 9 Molecular docking

3 讨论

PID病情较为反复,中医药由于其多靶点、多通路的作用机制,能在一定程度上更好地干预该类慢性疾病[10]。研究结果表明,PID的发生、发展过程主要包括病原微生物的感染、免疫系统的激活与炎症因子的释放等阶段。然而,当机体的免疫系统被激活后,炎症因子过度释放会加重感染部位的损伤,长期反复导致了PID的产生[11-12]。

本研究通过网络药理学结合分子对接的方法对丹白颗粒治疗PID的作用机制进行了探讨。通过文献检索结合数据库挖掘的方法获得丹白颗粒中的70个化合物与377个靶点。使用分子对接技术对预测的关键化合物与靶点进行了验证。如槲皮素是处方中牡丹皮、败酱草、土茯苓、白花蛇舌草、墓头回和椿皮中的化学成分,具有抗炎、抗菌和抗肿瘤等多种药理活性[13]。司丽君等[14]观察了槲皮素对伴刀豆球蛋白A诱导的T细胞和脂多糖诱导的B细胞增殖的影响,结果显示,经槲皮素处理后的T细胞数量、B细胞数量以及炎症因子数量均显著降低,表明槲皮素具有良好的抗炎作用,能促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,抑制T细胞、B细胞的增殖和炎症因子的产生。木犀草素是处方中败酱草的化学成分,具有抗炎、抗菌、抗糖尿病和抗过敏等多种药理作用。木犀草素可以减少自由基的生成,通过影响核因子κB(NF-κB )信号通路、MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路等炎症通路以及花生四烯酸的代谢抑制炎症因子的产生与表达[15]。周霄楠等[16]通过细胞实验进一步验证了木犀草素对于脂多糖诱导的细胞炎症模型的调控作用,结果显示,木犀草素可以显著抑制脂多糖诱导的细胞内一氧化氮(NO)、TNF-α、白细胞介素1β(IL-1β)以及IL-6含量的升高,具有良好的抗炎效果。山柰酚是处方中牡丹皮、败酱草、白芍和椿皮的化学成分,具有抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种药理活性。如山柰酚可通过抑制炎症因子IL-1β诱导的前列腺素E2和NO的产生,进一步抑制炎症反应[17-18]。柚皮素具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗纤维化和抗心律失常等药理活性[19]。研究结果表明,柚皮素能抑制环氧化酶2的表达进而减少前列腺素的合成,还能减少炎症因子TNF-α、NF-κB等的生成,从而减轻炎症反应[20-21]。上述化合物都是通过网络药理学预测结合分子对接验证得到的关键化合物,因此其可能是丹白颗粒发挥治疗PID作用的核心成分。

PPI网络的预测结合文献挖掘结果显示,PIK3CA、SRC、TP53、HSP90AA、Akt1、MAPK3、MAPK1、ESR1、EGFR、TNF-α、RELA和IL-6可能是丹白颗粒治疗PID的关键靶点。费红梅[22]对124例盆腔炎患者进行了血清炎症因子检测,发现患者血清中TNF-α、IL-1β等水平显著高于正常对照组,血清IL-4以及CD4+/CD8+水平明显低于对照组,由此可见,TNF-α等炎症因子可能是导致PID反复的原因之一。生殖系统感染后,Toll样受体(TLR)首先在免疫系统中被激活,其是一种模式识别受体,可以识别病原相关的分子模式[23]。输卵管炎是PID的一种,陈晓等[24]建立了输卵管炎小鼠模型,使用荧光定量聚合酶链反应检测小鼠输卵管组织中TLR2的mRNA水平,以及使用酶联免疫吸附试验检测小鼠血清TNF-α的表达,结果显示,模型组血清TNF-α水平显著高于空白组,而TLR2 mRNA的表达在28 d时显著低于3 d时,表明输卵管炎可能是由TLR2通过一系列信号转导产生大量TNF-α所诱发的。IL-6与PID密切相关,可能会导致盆腔局部组织粘连,加重原有损伤[25]。毕海平等[26]将60例妇科就诊患者分为对照组与盆腔炎组,检测两组患者血清IL-6水平,结果显示,盆腔炎组患者血清IL-6水平远高于对照组,差异有统计学意义。RELA是NF-κB的亚单位之一,它能精准地调控NF-κB信号通路,在一系列免疫反应和炎症反应相关的疾病中发挥着重要作用[27]。子宫内膜炎同样也是PID的一种,马红霞等[28]、尤昭玲等[29]使用革兰菌制作恒河猴子宫内膜炎模型,发现其血清炎症因子TNF-α、IL-1的表达水平升高,而二者表达水平升高后会促使NF-κB的激活,从而形成正向反馈导致原有炎症加重,接着使用药物进行干预后发现治疗组的NF-κB水平显著低于模型组,进一步得出结论,通过调控NF-κB的活化可以有效保护子宫内膜组织,有效缓解PID。EGFR是受体酪氨酸激酶中的表皮因子生长受体家族的成员之一,属于酪氨酸激酶型受体,在细胞信号传导、细胞生理过程中发挥重要作用[30]。EGFR表达量增多会增强上皮细胞对生长因子的敏感度,因此使生长因子受体更容易与生长因子配体结合形成络合物,从而影响输卵管上皮的增殖分化,导致炎症进一步加重[31]。胡晓玲等[32]使用自拟方通关汤对输卵管炎模型大鼠进行治疗,发现治疗前后输卵管上皮细胞中B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、EGFR表达的差异均有统计学意义,表明该药的作用机制可能是通过下调Bcl-2、EGFR的过表达来达到治愈输卵管炎的作用。丹白颗粒可能是通过调节上述关键靶点来发挥治疗PID的作用。

GO功能与KEGG通路富集分析结果显示,丹白颗粒治疗PID的靶点集中在多条炎症相关通路中。如PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路等。PI3K-Akt信号通路可以调节多种细胞因子,参与细胞分化、增殖、凋亡与新血管的生成等生物学过程[33-34]。当上游信号激活PI3K后,下游的Akt开始启动磷酸化进程,进而激活一系列的靶基因如COX-2、Caspase-9,促进细胞新陈代谢、凋亡和增殖等。研究结果表明,PI3K-Akt信号通路与子宫内膜癌的不良预后相关[35]。近年来,炎-癌转化的病理机制一直是研究的热点。在肿瘤的发生、发展过程中,炎症反应参与肿瘤的各个阶段,炎症因子与恶性肿瘤细胞周围的基质产生交互作用,炎症型肿瘤微环境不断促进肿瘤的生长[36-37]。因此,PI3K-Akt信号通路同样也会影响子宫内膜炎等炎症反应引发的疾病。网络药理学靶点预测结果发现,PIK3CA是丹白颗粒作用于PID的关键靶点,因此,本研究推测丹白颗粒可能通过调控PIK3CA,进而影响PI3K-Akt信号通路的生物学功能。

综上所述,丹白颗粒可能是通过NF-κB信号通路、MAPK信号通路和PI3K-Akt信号通路等通路作用于TNF-α、IL-6和EGFR等关键靶基因,发挥其治疗PID的作用。本研究主要采用数据挖掘开展,与已发表的基础研究具有很大程度的一致性,因此对后续的实验研究提供了借鉴并奠定了基础。