不同程度烟草白粉病感染秦烟99的DNA甲基化研究

铁丹 张保华 张军仓 赵继刚

摘要 ［目的］了解烟草白粉病对秦烟99 DNA甲基化水平的影响，探明其DNA甲基化在胁迫条件下对烟草的调控作用。［方法］结合聚丙烯酰胺凝胶电泳检测技术，对不同程度感染烟草白粉病秦烟99的基因组DNA甲基化水平进行MSAP分析。 ［结果］DNA甲基化在白粉病胁迫条件下调控烟草生长，秦烟99感染白粉病程度越高，其DNA甲基化水平越高。［结论］该试验通过研究感染不同程度烟草白粉病的秦烟99间的表观遗传多样性，为探明秦烟99生态适应性获得的表观遗传机制提供理论依据。该试验结果丰富了烟草基因组甲基化方面的研究内容，为今后研究烟草表观遗传学提供一定的参考。

关键词 烟草白粉病；秦烟99；DNA甲基化；MSAP；表观遗传

中图分类号 S435.72  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）13-0135-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.13.032

Study on DNA Methylation of Qinyan 99 Infected with Tobacco Powdery Mildew in Different Degrees

TIE  Dan， ZHANG  Bao-hua， ZHANG  Jun-cang  et al

（Baoji Tobacco Company Linyou Branch，Baoji， Shaanxi   721599）

Abstract ［Objective］ To understand the influence of Erysiphe cichoracearum DC. on DNA methylation level of Qinyan 99 seedlings and explore the regulation of DNA methylation on Nicotiana tabacum under stress. ［Method］ The genomic DNA methylation level of Qinyan 99 seedlings with different infection degrees of Erysiphe cichoracearum DC. was analyzed MSAP by using polyacrylamide gel electrophoresis technique. ［Result］ The higher the degree of Erysiphe cichoracearum DC. infection， the higher the DNA methylation level of Qinyan 99 seedlings. ［Conclusion］ In this study， the epigenetic diversity of Qinyan 99 infected with different degrees of tobacco powder virus was studied to provide a theoretical basis for exploring the epigenetic mechanism of Qinyan 99s ecological adaptation. The results of this experiment enrich the research content of Nicotiana tabacum genome methylation， and provide a certain reference for the future study of Nicotiana tabacum epigenetics.

Key words Erysiphe cichoracearum DC.;Qinyan 99;DNA methylation;MSAP;Epigenetics

作者簡介 铁丹（1996—），女，陕西宝鸡人，助理农艺师，硕士，从事逆境胁迫条件下的植物响应研究。

收稿日期 2022-08-22

烟草作为我国主要的经济作物，在国民经济中占有重要地位。但由于病虫害的发生，每年都会带来巨大的经济损失。所以，在烟草种植过程中各类病虫害的防治也成为当前研究工作重点。烟草白粉病的病原菌为二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum DC.），属于子囊菌亚门核菌纲白粉菌目白粉菌科白粉菌属（Golovinomyces orontii），其作为烟草的主要病害之一，给我国的烟草生产带来巨大的经济损失［1］。气象条件可以直接影响白粉病菌的侵染时间与分生孢子的繁殖数量，也可以显著影响白粉病的越夏、越冬、流行速度及严重程度［2-3］。白粉病会随着温度和湿度的增加，其发病速度也会增加，尤其是田间湿度过大和高温高湿交替出现情况下，病害会持续加重；此外，烟草徒长、种植密度过大导致的通风透光不良，也会造成白粉病发病严重。白粉病菌只存活于活体寄主，为专性寄生菌，一般侵染植物分为分生孢子萌发、附着胞形成、吸器产生、菌丝形成、生长和分生孢子形成［4］，其病原菌主要危害植株的叶片，严重时危害果实。植株在发病初期，叶片表面通常会出现褪绿斑点，形成白粉状病斑，随后连成一片，成为边缘不明显的白色粉状物，可降低植株的光合能力，严重时造成整株死亡［5-6］，从而影响烟草的产量和品质。

研究表明，表观遗传调控机制（DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和小分子RNAs（sRNAs））可影响植物表型可塑性［7］。在植物中由小分子RNA所介导的DNA甲基化模式最早在感染类病毒的烟草中发现［8］。DNA甲基化是植物生长发育、形态建成、逆境胁迫等过程中一种常见的表观遗传现象，也是植物逆境响应的重要机制，其通过调控植物开花、产量、抗性等与物种稳定性或品种一致性密切相关的性状来维持正常的生长发育［9-10］。DNA甲基化主要是高等真核生物中胞嘧啶残基的甲基化［11］，是植物中表观遗传效应研究最多的内容，也是最早发现的表观遗传途径之一。在植物中，胞嘧啶甲基化在以下3种不同的序列中发现：对称的CG和CHG位点（H = A，C，T）和不对称的CHH位点。这3种情况下的甲基化会在转座元件和重复序列中发生，它们通常与转录抑制相关［12］。但不同植物品种，即使是同一品种的不同发育时期和不同器官中的甲基化水平也有所不同［13］。研究表明，相同种属烟草的不同品种间甲基化修饰水平不同，其DNA甲基化水平在29.72%～43.37%［14］。Boyko等［15］研究发现，烟草感染普通花叶病毒后其基因组甲基化水平提高，但降低了与抗病相关的区域甲基化水平；生物胁迫可以诱导植物基因组DNA甲基化水平变化，改变基因的表达水平，从而逃避或耐受生物胁迫。Dowen 等［16］研究发现，DNA胞嘧啶甲基化在病原菌-寄主互作中，可调控寄主基因表达的方式防御病原菌，从而在植物生长、发育及响应生物胁迫等方面发挥重要作用；DNA甲基化可能参与了病原菌-寄主互作的抗病信号转导［17］及基因表达水平变化与DNA甲基化程度密切相关［18］。因此，笔者通过植物甲基化MSAP技术，研究烟草白粉病毒不同感染程度的秦烟99间的表观遗传多样性，为探明秦烟99生态适应性获得的表观遗传机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

“秦烟99” 为茄科烟草属烟草（Nicotiana tabacum）草本植物。依据白建保（2010年）烟草白粉病病害严重度分级标准采集样品，于 2021年7月20日从陕西省宝鸡市麟游县九成宫镇丰塬村大田采集4种不同感染程度（0、3、7及9级）的秦烟99叶片。采集处于同一天移栽的同一片烟田内不同发病程度的秦烟99叶片，采集的个体间聚力不低于50 cm；每种程度至少采集3株作为重复处理。随后，为尽量减少叶表面的污染，将用75%的乙醇轻轻地擦洗所采集的烟草叶片，装在茶包袋中，再置于装有硅胶的塑封袋中干燥，用于后续植物DNA提取。

0级，无病斑；

1级，病斑面积占叶片面积的5%以下；

3级，病斑面积占叶片面积的6%～10%；

5级，病斑面积占叶片面积的11%～20%；

7级，病斑面积占叶片面积的21%～40%；

9级，病斑面积占叶片面积的41%以上。

1.2 试验方法

1.2.1 植物基因组的提取。

用植物DNA提取试剂盒（BioTeke，北京）提取秦烟99叶片DNA，所提取的DNA放置在-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 基因组DNA浓度和纯度检测。

用核酸测定仪（BioSpec-nano）分别于260和280 nm处分别测定吸光度值以检测DNA的浓度，一般情况认为OD260/OD280的值在1.7～1.9纯度均较好。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，随后用ddH2O将DNA浓度均稀释为100 ng/μL。

1.2.3 MSAP（甲基化敏感多态性）分析。

1.2.3.1 基因组DNA双酶切。

采用核酸内切酶Eco RI（识别六碱基）分别与同裂酶Msp I（识别四碱基）和Hpa II组合对植物样本DNA进行双酶切。酶切体系总体积为20 μL，包括5 μL cDNA、2 μL Cutsmart TM Buffer、1 μL Eco RI、1 μL Hpa II/Msp I、用ddH2O补足至20 μL，将混合物混匀于37 ℃酶切5 h。为使酶彻底失活，Eco RI+Msp I酶切体系于65 ℃灭活20 min；Eco RI+Hpa II于80 ℃ 灭活20 min，酶切产物冰箱4 ℃保存。

1.2.3.2 酶連接反应。

人工设计的与Eco RI+Hpa II/Msp I酶切位点互补的人工接头加于酶切片段两端（表1）。接头使用前需在100 ℃的条件下变性5 min。酶连体系总体积为30 μL，包括5.0 μL 酶切产物、3.0 μL 10×T4 DNA Buffer、0.5 μL T4 DNA ligase、1.0 μL Eco RI adaptor、1.0 μL Hpa II/Msp I adaptor、用ddH2O补足至30 μL，将混合物混匀于16 ℃过夜连接，连接产物冰箱4 ℃保存。

1.2.3.3 预扩增。

预扩增体系总体积为30.0 μL，包括3.0 μL 连接产物、0.5 μL Eco RI pre-selective primer、0.5 μL Hpa II/Msp I pre-selective primer、17.5 μL  2 × Taq PCR master mix，用ddH2O补足至30 μL。PCR预扩增反应程序：72 ℃ 2 min →94 ℃ 2 min →94 ℃ 30 s → 56 ℃ 30 s → 72 ℃ 1 min（25个循环）→ 72 ℃ 10 min。预扩增产物稀释30倍，4 ℃保存备用。

1.2.3.4 选择性扩增。

选择性扩增体系总体积为50 μL，包括1 μL 稀释30×预扩产物、1 μL Eco RI selective primer、1 μL Hpa II/Msp I selective primer、25 μL 2 × Taq PCR master mix，用ddH2O补足至50 μL。降式PCR扩增反应程序：94 ℃ 2 min → 94 ℃ 30 s → 65 ℃ 30 s → 72 ℃ 1 min（15个循环，退火温度每个循环降1 ℃）→ 94 ℃ 30 s → 56 ℃ 30 s → 72 ℃ 1 min → 72 ℃ 10 min；将产物于70 ℃灭活10分钟，4 ℃保存即可。

1.2.3.5 聚丙烯凝胶电泳检测（PAGE）。

配制5%聚丙烯酰胺凝胶电泳对选择性扩增产物进行进一步分离：于大烧杯中加入33.3 mL Acr和20 mL 5×TBE Buffer，混合用玻璃棒搅拌均匀后，加入700 μL 10%的APS和65 μL TEMED溶液作为助凝剂，随后用ddH2O补足至100 mL，迅速混匀后立即用10 mL移液枪向玻璃板内灌胶［19］。制作好的凝胶板组装放入含有1×TBE的电泳槽中，预电泳1 h使胶面温度达到55 ℃时上样，260 V下电泳3.5 h。电泳结束后，剥离2块玻璃板，将长玻璃板上的电泳条带进行固定、银染和显色，ddH2O冲洗干净后，用凝胶成像系统（GBoxF3，GeneCompany Limited，UK）拍胶保存，并进行条带计数和分析。

1.3 数据分析

用Excel 2013（Microsoft、WA、USA）统计MSAP凝胶电泳图上100～500 bp条带，记录条带的有（1）和无（0）情况。DNA甲基化的限制性内切位点（5′SCCGG）有3种不同的类型：①Eco RI-Hpa II和Eco RI-Msp I酶切片段都存在（1/1）表示未发生甲基化状态；②Eco RI-Hpa II（1/0）或 Eco RI-Msp I（0/1）片段只存在1种，表示发生甲基化状态（半甲基化或者双链内部甲基化）；③Eco RI-Hpa II and Eco RI-Msp I片段（0/0）被认为是可能由片段缺失或超甲基化造成的无信息位点［20］。在msap包中计算未甲基化、半甲基化、完全甲基化或不存在靶标的百分比，用半甲基化及全甲基化的总和衡量总甲基化水平［21］。对统计形成的0/1矩阵利用R软件（RStudio，New Zealand）的msap软件包进行统计分析；随后，用分子方差分析（AMOVA）检查整体分化和两两间的差异，用pegas包进行AMOVA分析，将Phi-st作为固定指数（分子数据中Fst的类似物）［22］；用ade4包进行主坐标分析（PCoA）［23］。

总扩增条带数＝Type I+Type II+Type III+Type IV

总甲基化条带数＝Type II+Type III

未甲基化率＝Type I条带数/总甲基化条带数×100％

半甲基化率＝Type II条带数/总甲基化条带数×100％

全甲基化率＝Type III条带数/总甲基化条带数×100％

MSAP＝（Type II+Type III条带数）/总甲基化条带数×100％

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果

由于MSAP技术对基因组DNA质量要求很高，模板DNA的纯度直接影响后续酶切、扩增以及MSAP谱带的稳定性，为满足MSAP试验要求，用核酸测定仪（BioSpec-nano）分别于260和280 nm处分别测定吸光度值以检测DNA的浓度，一般情况认为OD260/OD280在1.7～1.9纯度较好。用1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。琼脂糖凝胶电泳结果显示样本所提取的秦烟99叶片基因组DNA主带清晰，无降解、无杂质现象，符合试验对DNA的要求。随后用ddH2O将DNA浓度均稀释为100  ng/μL可用于后續甲基化MSAP检测（图1）。

2.2 预扩增结果

用2%琼脂糖凝胶电泳检测预扩增产物，结果表明预扩增产物均匀弥散，且连续成片，有部分有条带（图2），符合MSAP选扩模板的要求。

2.3 MSAP试验结果

依据以下标准统计聚丙烯酰胺凝胶条带，选择较为清晰的条带进行统计，有条带的记为“1”，无条带的记为“0”。依据Schulz等［20］的相关研究将2种酶组合所产生的条带类型分为4种情况：类型I，H和M均有条带，记为（1，1），表示未发生甲基化；类型II，H有条带，而M无条带，记为（1，0），表示发生半甲基化；类型 Ⅲ，H无条带，而M有条带，记为（0，1），表示发生全甲基化；类型 Ⅳ，H和M均无条带，记为（0，0），该类情况较为复杂，Schulz等［20］认为很可能是基因突变的结果，所以一般作为无信息处理。聚丙烯酰胺凝胶电泳结果见图3。

2.4 白粉病对DNA甲基化水平的影响

由表2可知，与CK（对照组）相比，不论烟草白粉病发病程度高低，其总甲基化水平程度均上升，Ⅶ级发病程度诱导了最低的未甲基化和半甲基化水平，并随着发病程度的增加，其DNA甲基化水平上升的程度越高，其总甲基化水平依次为Ⅲ级为24.31%，Ⅶ级为27.24%，Ⅸ级为29.61%。因此，不同程度的白粉病感染情况会影响烟草的DNA甲基化水平，其发病程度越高，总甲基化程度越高。

由表3可知，对照组（CK）的烟草与其他不同发病程度的烟草成对比较P值分别为0.048、0.029和0.027（P值均小于0.05），表明是有差异的。因此，烟草白粉病对秦烟99的DNA甲基化水平有显著影响（P<0.05），且这种差异受到白粉病不同发病程度的影响。

秦烟99 DNA甲基化的PCoA分析图显示处理组之间存在显著差异（Phi-ST=0.335 6，P<0.000 1）。2个主坐标轴分别解释了甲基化差异的 12.0%和22.3%。Ⅲ、Ⅶ、Ⅸ 均与CK组无重叠区域，但CK和 Ⅲ 距离较近，Ⅶ 和Ⅸ 距离较近（图4）。

3 结论与讨论

研究表明，DNA甲基化修饰会导致植物的某些重要性状发生变化。如不同的生态条件会影响烟草基因组的表达，K326烤烟在不同生态区的甲基化水平不同［24］。该研究中，不同程度的白粉病感染秦烟99叶片会改变其DNA甲基化水平，并随着感染程度的增加，DNA甲基化水平升高的程度越大。目前，关于DNA甲基化参与植物抗病的研究，主要集中于病原菌对植物基因组甲基化水平的影响，导致基因的表达水平发生变化，从而引起植物响应的生理生化变化，参与植物的抗病反应［25］。如Pst侵染拟南芥后，会降低CpG和CHH甲基化水平，但提高防御相关基因的表达水平［16］。DNA甲基化是在转录水平对基因进行调节，甲基化程度的高低直接影响了基因表达的活性。甲基化程度低，基因表达活跃；甲基化程度高，基因低表达或不表达。甲基化水平调控基因表达，基因表达时，其表现为低的甲基化水平；当在植物某阶段不需该基因表达时，基因的启动子或编码区会重新发生甲基化，抑制基因的转录并终止其表达［26］。因此，秦烟99感染烟草白粉病后，DNA甲基化通过调控基因表达来满足植物不同生长阶段的需求，这对烟草的正常生长及适应复杂多变的外界环境提供了良好的调控机制。

该研究表明DNA甲基化介导不同烟草白粉病感染秦烟99的生长，使其适应环境正常生长，但仍存在不足，如该调控基因的表达方式是依赖目标基因的甲基化还是对目标基因起调控作用的其他基因的甲基化仍有待进一步研究。

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