猪链球菌分离鉴定及耐药性与毒力基因分析

文│赵凤利［辽宁省台安县农业发展服务中心（动物疫病预防控制中心）］

猪链球菌（Streptococcus suis，S. suis）作为一种重要的人畜共患病原微生物，可引起猪肺炎、败血症、脑膜炎及关节炎等疾病。我国分别在1998年和2005年暴发了人感染猪链球菌的疾病，使得全世界对该疾病格外关注。猪链球菌1型（SS1）、2型（SS2）、7型（SS7）和9型（SS9）是临床分离率最高的四个血清型，也是其众多血清型中毒力较强的。由于猪链球菌菌株的血清型繁杂，长久以来疫苗的保护效果不理想，猪链球菌病也成为困扰我国养猪业发展的最重要的细菌性传染病之一。

近年来，猪链球菌病在我国的流行呈明显上升趋势，特别是在猪群发生猪蓝耳病、猪圆环病毒病或副猪嗜血杆菌病后极易继发或并发猪链球菌感染，给养猪业带来严重的经济损失。本试验从辽宁省鞍山市某猪场疑似猪链球菌感染的死亡猪体内采集不同脏器，从中分离培养细菌，并进行染色、镜检、生化试验，采用16s rRNA鉴定法和血清型鉴定法对分离菌株进行病原学鉴定，进一步利用药敏试验和毒力基因检测对分离株的耐药性和携带毒力基因的情况进行分析，以期对猪链球菌病的防治提供数据参考。

一、材料和方法

1.样品来源。所有样品均采集自辽宁省鞍山市某猪场疑似感染猪链球菌的病死猪的淋巴结、脾、肝和肺。

2.主要试剂与仪器。血琼脂平板购自广东环凯微生物科技有限公司，新生牛血清和Todd-Hewitt broth（THB）培养基均购自北京索莱宝科技有限公司，药敏纸片购于青岛水生环境科技有限公司，革兰氏染色试剂盒购自北京奥博星生物技术有限公司。

台式离心机购自湘仪离心机仪器设备有限公司；核酸电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；PCR扩增仪、凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。

3.引物的设计与合成。参照文献合成猪链球菌的16S rRNA序列引物用于分离菌株的PCR鉴定试验，根据荚膜多糖基因序列cps1I、cps2J、cps7H和cps9H进行设计鉴别猪链球菌1、2、7、9四种主要致病血清型的引物用于血清分型试验，参考文献设计5对毒力基因溶血素（Sly）、谷氨酸脱氢酶（gdh）、溶菌酶释放蛋白（m rp）、毒力相关因子（Orf2）和细胞外蛋白因子（ef）的扩增引物，上述引物均由吉林省长春市库美生物科技有限公司合成。本试验所用引物序列详见表1。

表1 引物序列信息

4.猪链球菌的分离培养及革兰氏染色。无菌剪取病猪的淋巴结、脾、肝和肺等病料，将样品编号、匀浆后，按1∶50转接至含5毫升THB培养基的试管中，37℃ 230转/分钟震荡培养8小时后，将菌液接种于血琼脂平板上，37℃培养16～20小时。挑取特征性单菌落进行革兰氏染色后镜检观察。

5.猪链球菌的PCR鉴定。选取革兰氏染色阳性的、链状的单菌落接种至THB培养基中继续培养16～20小时后进行菌液PCR鉴定。PCR扩增体系如下：依次加入5×Buffer 4微升、Prime STARRHS聚合酶0.5微升，2.5毫摩/升 dNTPs2微升、上、下游引物各0.5微升、菌液模板1微升，最后加灭菌的ddH2O至终体积为20微升。PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，35个循环后72℃延伸10分钟。将扩增后的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，观察结果。

6.猪链球菌的生化试验。取适量猪链球菌分离株的菌液接种于细菌微量生化反应管中，37℃条件下静置培养48小时，观察反应管的颜色变化，分析该菌株的生化反应特性。

7.猪链球菌的血清型鉴定。采用PCR方法，利用表1中的引物序列对分离得到的猪链球菌进行血清分型。

8.猪链球菌的耐药性分析。将鉴定得到的猪链球菌菌株按照1∶100接种于THB培养基中，于37℃振荡培养16～20小时，用灭菌的PBS调整浊度为0.5MCF后均匀涂布于血琼脂平板上，37℃静置培养24小时后，采用纸片扩散法对分离到的猪链球菌进行药敏试验分析。

9.猪链球菌的毒力基因检测。选择猪链球菌的5种主要毒力因子作为鉴定基因，以分离到的猪链球菌的DNA作为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为：Prime STARRHS聚合酶0.5微升，5×Buffer 4微升，2.5毫摩尔/升 dNTPs 2微升，DNA 1微升，上、下游引物各0.5微升，补齐ddH2O至20微升。PCR扩增条件为：95℃预变性10分钟，95℃变性40秒，50～58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，35个循环后72℃延伸10分钟。将扩增得到的PCR阳性产物送库美生物技术有限公司测定序列，登录NCBI对所测序列进行BLAST比对分析。

二、结果与分析

1.猪链球菌分离培养及鉴定结果。从病死猪的脏器中分离出的细菌在THB培养基和血平板上均能很好的生长，进行革兰氏染色后发现菌体呈蓝紫色、短杆状，且多是3个以上形成链状，而分离的菌株在血平板上生长时出现典型的β溶血环。挑取单菌落经16S rRNA鉴定后，确认分离出的细菌为猪链球菌。进一步的生化试验结果显示，该菌株可分解乳糖、蔗糖等多种糖类，不分解山梨醇和甘露醇，触酶试验等均为阴性，这与猪链球菌的生化特性相符（表2）。血清型PCR鉴定结果显示，该分离菌株为血清9型。

表2 猪链球菌分离株的生化试验结果

2.猪链球菌的耐药性结果。利用药敏试验分析猪链球菌分离株对13种抗菌药物的耐药情况，结果显示，该分离株对先锋、菌必治等6种抗菌药物敏感，而对强力霉素、乙酰螺旋霉素、林可霉素、磺胺异恶唑和新霉素这5种抗菌药物均表现出耐药，且呈多重耐药（表3）。

表3 分离的猪链球菌的药敏结果

3.猪链球菌的毒力基因分析结果。对分离得到的猪链球菌分离株进行5对毒力基因的扩增，结果显示，该分离株携带的毒力基因有Sly、gdh、mrp和Orf2。

三、讨论和结论

猪链球菌是当前猪场中一种常见的细菌性病原，猪链球菌的无毒和强毒株均可从猪群中分离。近年来，随着大规模集约化养猪模式发展，给猪链球菌的感染和传播提供了可乘之机，造成了猪链球菌病的发生和流行。在本试验中，通过细菌分离培养、革兰氏染色镜检、16S rRNA鉴定和生化试验分析的方式确定从病猪不同病料中分离到的细菌是一株猪链球菌。PCR作为猪链球菌的鉴定方法具有很高的准确性，而生化反应结果是常规细菌鉴定的一个重要参考，对PCR方法起到很好的佐证作用。进一步经血清型鉴定，该株猪链球菌为血清9型，而该血清型属于主要的人畜共患血清型之一。虽然我国至今尚未有SS9感染人的报道，但近年来SS9在临床中的分离率逐年递增，且有扩大流行的趋势，应引起养猪场的高度关注。由于猪链球菌灭活疫苗的免疫效果不够理想，临床中防治猪链球菌仍然依靠抗菌药物，养猪场可根据药敏试验结果首选高敏感药物。有研究证实，猪链球菌对常用的抗菌药物有较高的耐药性，且存在多重耐药性和耐药基因遗传的情况。本试验的药敏检测结果显示，该分离株呈现多重耐药，表明该猪场的猪只感染的猪链球菌耐药现象较为严重。猪链球菌的致病性强弱与其携带的毒力基因有密切联系，其中细胞外蛋白因子、溶血素和溶菌酶释相关蛋白是其主要的毒力因子。在之前的研究中，关于SS9的毒力因子研究很少，而大多数SS9菌株很少检出上述3种毒力基因。但近年来，在不同国家的SS9分离株中分别检测出了Sly基因和mrp基因，而本研究中从辽宁分离到的这株SS9也携带这两种主要毒力基因，提示这株分离株可能具备较强的毒力和致病性，但还需要进一步在动物体内进行致病力分析才能得到确认。