治疗性抗体免疫原性的研究进展

于兴艳 综述，李涛，杨毅 审校

1.江西中医药大学药学院，江西南昌 330004；2.南通市海门长三角药物高等研究院，江苏南通 226133；3.百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司，北京102609

自1986 年鼠源单克隆抗体药物莫罗莫那单抗（muromonab-CD3）成功研发以来，由于抗体药物具有高活性、高特异性及副作用低等优点，已成为生物制品领域的研究热点之一。目前，全球已有超过100个抗体药物获得美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准上市，另有数百种抗体药物处于不同的临床研发阶段［1-2］，美国FDA 批准上市的主要治疗性抗体相关信息见表1。抗体药物在肿瘤、代谢性疾病和自身免疫疾病等领域取得了理想的治疗效果，同时也丰富了疾病的治疗手段，使患者的治疗向精准化、个性化方向发展。

表1 1986—2021年美国FDA批准上市的主要治疗性抗体Tab.1 Major therapeutic antibodies approved by FDA from 1986 to 2021

尽管治疗性抗体在临床上获得了理想效果，但抗体药物的免疫原性可能引发机体抗药物免疫反应，从而诱导抗药抗体（anti-drug antibody，ADA）的产生［3-5］。ADA 可通过中和／非中和药物活性，影响药物的清除和生物利用度，改变药物药代动力学和药效学特性。在临床中，ADA 可干扰或阻断药物的治疗效果，并可能导致不同程度的不良反应；在临床前研究中，ADA 可干扰候选分子的有效性评价和分子筛选。本文就影响治疗性抗体免疫原性的因素、ADA 的类型及形成机制、ADA 的检测方法、降低免疫原性的方法及针对高免疫原性药物的临床前动物模型研发等作一综述，以期为抗体药物的研发提供参考。

1 影响治疗性抗体免疫原性的因素

治疗性抗体免疫原性受多种因素的影响，总体可归纳为患者和药物相关因素两个方面。

1.1患者相关因素 患者相关因素主要包括患者的遗传背景、疾病类型、患病状态等。患者的遗传背景如人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因的多态性，可通过T 细胞依赖性（T cell dependent，Td）途径响应程度影响ADA 的产生，携带HLADRb-11、HLA-DQ-03及HLA-DQ-05 等位基因的患者在接受抗体治疗后形成ADA 的风险较高［6］。不同类型疾病及患者的疾病状态存在显著的个体差异，对ADA产生的风险具有较大影响。相较于患有恶性肿瘤等存在免疫系统功能缺陷或接受免疫抑制剂治疗的患者，自身免疫疾病患者由于机体过度活跃的免疫系统，更易产生ADA［7-9］。

1.2药物相关因素 药物相关因素主要包括药物的内源性因素（如异源氨基酸序列、分子大小、结构及产品纯度等）及外源性因素（如给药剂量、给药途径、给药频率、药物配方、杂质及储存条件等）［10］。由于人鼠之间的种属差异较大，鼠源抗体存在较大比例的异源氨基酸序列，导致早期鼠源抗体更易诱导ADA的形成，如在接受莫罗莫那单抗治疗的患者中，免疫原性反应发生率达25%［11］。一般来说，相对分子质量大于10 000或分子结构复杂的药物通常显示出较高的免疫原性，天然抗体结构及纳米抗体具有较小的相对分子质量，可大幅降低免疫原性；非天然存在的双抗／多抗则具有较为复杂的结构，免疫原性更高［12-14］。不同的给药方式影响抗原递呈细胞对抗原的提呈能力，进而影响免疫反应的发生，如皮下注射后产生ADA 的风险高于静脉注射［15］。同时，高剂量、高频次的给药往往更易诱导产生ADA［5］。另外，配方不合理、杂质残留、储存条件及糖基化模式等的改变，均可能引起治疗性抗体的聚集或变形，导致发生免疫原性反应的风险增加［16］。因此，提高药物的稳定性，降低药物聚集几率，也是降低药物免疫原性的主要途径之一。

2 ADA的形成机制及类型

2.1ADA的形成机制 抗体可通过Td及T细胞非依赖性（T cell independent，Ti）途径诱导产生ADA［17-18］。在Td 途径中，治疗性抗体作为抗原，经抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APCs）摄取并内化后，通过其表面的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）与T细胞受体相互作用，并将抗体表位提呈给辅助性T 细胞（helper T cells，Th），Th 与B 细胞接触并分泌相关细胞因子诱导B 细胞向浆细胞增殖和分化，形成的浆细胞能够合成并分泌针对该治疗性抗体的特异性ADA。另外，机体也可通过Ti 途径诱导ADA，具有多个抗原表位的治疗性抗体可直接与B 细胞受体（B cell receptor，BCR）相互作用，最终刺激浆细胞合成ADA［5］。

2.2ADA 的类型 ADA 可分为中和抗药抗体（neutralizing anti-drug antibodies，NADAs）及非中和抗药抗体（non-neutralizing anti-drug antibodies，non-NADAs）两种类型［17,19］。NADAs 具有与治疗性抗体相同的抗原结合表位，直接阻断或干扰药物与靶标的结合，从而影响药物的生物活性及药效；non-NADAs 不具有与治疗性抗体相同的抗原结合表位，因此不影响药物与对应靶点的结合，但non-NADAs 可结合治疗性抗体的其他区域，促进抗体免疫复合物的产生，加速体内药物的清除速率，进而影响药物治疗效果［19］。

3 ADA的检测方法

在治疗性抗体的研发过程中，免疫原性及ADA的检测和评估至关重要。针对治疗性抗体的免疫原性检测，美国FDA 于2019 年发布了《治疗性蛋白产品的免疫原性检测——开发和验证抗药性抗体的检测方法》指导原则［20］，为ADA 分析方法的建立及验证提供了依据。目前，针对ADA 检测方法的研究主要基于ELISA 法，即通过连接不同标记的特异性抗体分子来检测ADA，还可采用电化学发光法、表面等离子体共振法及放射免疫沉淀法等检测ADA［12］。在临床前研究中，由于物种差异，药物在动物中的免疫原性不能真实反映在人体中的效果。开展HLA结合试验、T 细胞刺激试验、外周血单核细胞刺激试验等基于人源组织或细胞的检测方法［18，21］，可为下一步临床试验中ADA 发生率的预测提供更加真实可靠的依据。另外，基于蛋白质组学研究构建的MHC-Ⅱ多肽表位文库，也为药物免疫原性的预测奠定了基础［22］。在Ⅰ期临床试验中，当抗体首次在人体中使用时，应仔细分析ADA 的形成与药物药代动力学、药效学及毒理学之间的关系，以便更好地规避ADA可能带来的风险［5］。

4 降低治疗性抗体免疫原性的方法

4.1制备人源化抗体 ADA 的产生限制了鼠源单克隆抗体在临床上的进一步应用。为能获得安全有效的治疗性抗体，研究者通过提高抗体序列中人源氨基酸序列的比例，以降低鼠源单克隆抗体的强免疫原性。1984 年，MORRISON 等［23］通过基因重组技术将鼠源单克隆抗体的可变区基因与人抗体的恒定区基因连接构建了第一代人-鼠嵌合抗体，不仅保留了鼠源单克隆抗体与抗原特异性结合的能力，同时也降低了鼠源单克隆抗体的免疫原性，如利妥昔单抗（Rituximab）。由于嵌合抗体序列中仍保留约30%鼠源可变区基因，还可能诱导ADA，通过互补决定区（complementary determining region，CDR）移植等技术［24］，将非人源抗体CDR 移植至人抗体的骨架区（framework regions，FR），从而构建出人源化抗体，抗体人源化程度可达90%以上，免疫原性得到进一步降低。噬菌体展示技术及全人源抗体转基因小鼠等新技术的出现也促进了全人源抗体药物的开发［25-26］。噬菌体展示技术主要是用目标蛋白对构建的人抗体噬菌体文库进行高效筛选，一般可在较短的周期内获得与目标蛋白特异性结合的抗体；而人源抗体转基因动物则是将人抗体序列通过转基因技术，随机或原位插入动物基因组中，动物机体受到抗原刺激后，能够分泌针对该抗原的人鼠嵌合抗体或全人源抗体。目前，全球已有多家医药公司开发出人源抗体转基因动物平台［27］（见表2）。相比于噬菌体展示技术，从人源抗体转基因动物中获得的抗体不仅更加符合抗体自然产生过程，如抗体类型的转换、克隆选择及亲和成熟等，且抗体的成药性及安全性等均得到显著提升［26］。人源抗体转基因动物平台已成为人-鼠嵌合抗体／全人源抗体药物的主要研发手段，约70%已获批上市的人源抗体的研发源于该技术平台，如纳武单抗（Nivolumab）、伊匹木单抗（Ipilimumab）及奥法妥木单抗（Ofatumumab）等。

表2 主要的人源抗体转基因动物平台Tab.2 Major humanized antibody transgenic animal platforms

与鼠源单克隆抗体比较，通过抗体工程技术或人源抗体转基因小鼠平台开发的全人源抗体可显著降低治疗性抗体的免疫原性，从而推动抗体药物的研发及应用，但实际临床应用中，仍存在发生ADA的风险。

4.2去免疫化 免疫原性的主要驱动因素之一是治疗性抗体中存在的人T 细胞表位［18］。抗体药物的T细胞表位在抗原递呈细胞中暴露后，将与MHC 形成复合物，并提呈给Th 细胞，随后激活一系列免疫反应，促进机体持续产生中和抗体，影响抗体药物的治疗效果［28］。MAZOR 等［29］研究证实，通过去除抗间皮素免疫毒素SS1P 中的人T 细胞表位而获得的免疫毒素LMB-T20 在小鼠体内不会诱导ADA 的产生；ETTINGER 等［30］研究发现，当凝血第八因子（FⅧ）中的免疫显性表位DRB1*01：01 被去除后，FⅧ蛋白的免疫原性显著降低且蛋白活性保持不变。因此，通过基因工程技术去除抗体序列中潜在的T细胞表位（即去免疫化）是降低治疗性抗体免疫原性的一种有效方法。一般来说，抗体药物首先经过抗原表位检测，通过人MHC 多样性库筛选后确定主要的T 细胞表位，并将这些T 细胞表位进行突变，从而降低或消除抗体药物的免疫原性［18，31］。去免疫化的实质是阻断抗原与抗体的识别，因此，也可通过聚乙二醇化、糖基化、还原甲基化及蛋白融合等技术屏蔽治疗性抗体的免疫原性表位［32］，从而阻断抗原与抗体的识别，进而改善药物的免疫原性。

4.3制备纳米抗体 1993年，HAMERS-CASTERMAN等［33］首次发现，在骆驼血清中大量存在着一种天然缺失轻链的重链抗体，与传统的IgG抗体不同，该重链抗体仅含有1个重链可变区和2个常规的CH2与CH3区。通过分子生物学技术克隆并重组表达重链可变区，可获得仅含有1条重链可变区的单域抗体，其相对分子质量仅有12 000～15 000，分子高度与直径均为纳米级，因此也被称为纳米抗体［13］。纳米抗体的低免疫原性与其相对分子质量和分子结构密切相关。一方面，由于相对分子质量小，纳米抗体在体内可被快速代谢，避免毒性的积聚；另一方面，纳米抗体的VHH结构域与人抗体VH结构域具有高度同源性［34］，能够有效避免机体免疫反应的发生。近年，纳米抗体凭借免疫原性低、肿瘤组织渗透性强及生产成本低等优点，在影像学诊断和疾病治疗等领域受到越来越多的关注［35-36］。

5 治疗性抗体免疫原性研究的适用动物模型

药物候选分子在进入临床试验前，通常需要在动物体内进行安全性及有效性测试。随着全人源抗体及其他形式药物的出现，导致药物候选分子在动物模型中具有较高的免疫原性，这可能会导致原本有潜力的候选分子在临床前动物模型筛选阶段得到不真实的药效及毒性结果，如默克公司研发的双功能融合蛋白Bintrafuspalfa（M7824）被证实在免疫功能正常的小鼠中能够产生强烈的ADA，从而减弱该药的抗肿瘤作用，但在B 细胞缺陷小鼠中其免疫原性能够被避免，同时显示M7824具有较好的抗肿瘤效果［37］。因此，开发能够真实反映候选分子药效，且不发生较高免疫原性的动物模型，对于新药研发尤为重要。

B 细胞在抗体合成中发挥重要作用，通过清除小鼠体内的B 细胞以避免机体形成ADA，将有效促进药物候选分子的筛选。目前主要可通过抗CD20／CD19抗体及Igh基因修饰两种方式清除B细胞。

5.1抗CD20／CD19抗体清除B细胞 CD20、CD19是特异性表达在B细胞表面的重要抗原分子，抗CD20／CD19抗体通过抗体的可结晶片段参与抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用及补体依赖的细胞毒性作用等生物学效应，诱导B 细胞耗竭［38-39］。WATANABE 等［40］对肺移植（lung transplantation，LT）小鼠模型研究发现，在使用CD20抗体清除小鼠体内的B细胞后，LT小鼠的缺血再灌注损伤后的慢性排斥反应（chronic rejection reaction，CR）及纤维化症状均得到改善。

5.2Igh 基因修饰 抗体清除B 细胞是目前构建B 细胞缺陷小鼠的常用方法之一，但该方法只能暂时、不彻底地耗竭B细胞［8］，且抗体半衰期短，需反复给药，实验成本较高。BCR 对于B 细胞的成熟和分化至关重要，其形成依赖于免疫球蛋白重链和轻链的重排与组装。在重排过程中，Ig 重链基因的组装和表达先于轻链基因，即DH与JH基因片段连接，随后VH与DJH 复合物重排。通过轻、重链的重排和组装，BCR 可表达于B 细胞表面，介导B 细胞的发育及分化［41］。CHEN等［42］研究发现，在胚胎干细胞（embryonal stem cell，ES）中通过基因靶向技术删除JH基因片段后，由于DH至JH的重排中断，导致Ig基因重排受阻，使B 细胞的分化停止于前B 细胞阶段，从而阻断了B 细胞进一步成熟和分化。LAN 等［37］借助此类小鼠模型，有效地避免了M7824免疫原性的干扰，同时显示出M7824 具有较好的抗肿瘤活性。因此，通过基因编辑技术构建Igh基因修饰的B 细胞缺陷小鼠，可用于高免疫原性药物候选分子的前期筛选及体内药效评价研究。

6 小结与展望

治疗性抗体的免疫原性不仅会影响药物在临床使用时的安全性和有效性，还可能干扰临床前候选分子的筛选，导致原本具有应用价值的药物被遗漏。药物的免疫原性受宿主和药物相互作用的影响，且免疫原性检测的结果与检测方法及检测标准密切相关，因此药物免疫原性评估仍面临一定挑战。加强对治疗性抗体免疫原性的监管，开发准确性高、适用性强的定量检测技术，建立高效合理的药效筛选动物模型及深入研究ADA 形成的分子机制等，不仅会在最大程度上减少免疫原性带来的不利影响，还可在降低药物研发成本及规避风险的同时，加快新药研发进程，最终为患者提供更加安全有效的抗体治疗药物。