三七皂苷R1对碘美普尔400诱导肾小管上皮细胞损伤的影响

龙芳敏,吕 梁

(1. 昆明理工大学附属医院(云南省第一人民医院),云南 昆明 650032;2. 右江民族医学院基础医学院,广西 百色 533000)

随着医学技术的发展,碘对比剂广泛用于放射诊断和介入治疗,如今碘对比剂成为急性肾损伤(AKI)的第三诱因［1］。据报道,无危险因素的患者,对比剂所致急性肾损伤(contrast-induced acute kidney injury,CI-AKI)发生率约为2%,轻度至中度肾功能不全和糖尿病患者的发生率为9%～50%,每年15万CI-AKI患者中的1%需透析和长期住院,透析费约3 200万美元［2］。目前CI-AKI发生机制尚未明确,也无此病防治的理想药物,因此针对CI-AKI防治药物的研究仍具有重要的临床价值及必要性［3-5］。三七皂苷R1来源于三七的特征皂苷,其可通过PI3K/Akt、TGF-β/Smads等途径抑制细胞凋亡来发挥心脑血管保护作用［6-8］,而它对CI-AKI的影响鲜有报道。另外含螯合剂或非螯合剂的碘对比剂均可导致CI-AKI的发生,但由于螯合剂具有肾毒性,因此大多只研究含螯合剂的碘对比剂如碘海醇等诱导的CI-AKI,而基于非螯合剂碘对比剂诱导肾小管上皮细胞损伤的相关参数及其诱导CI-AKI的防治报道少见［9-10］。因此,本研究采用目前临床中唯一不含螯合剂的碘美普尔400来诱导NRK-52E细胞损伤,观察三七皂苷R1对该损伤的影响,探讨核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)/血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)途径与CI-AKI的调控关系,为进一步开发中草药三七奠定基础,也为中药对分子靶向防治非螯合剂碘对比剂引起的CI-AKI提供新思路。

1 实验材料与方法

1.1细胞株 NRK-52E细胞,赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。

1.2实验药物、试剂 三七皂苷R1(纯度≥98%,B21099),上海源叶生物有限责任公司;碘美普尔400注射液(MP8352R),上海博莱科信谊药业有限公司;胎牛血清,BI公司;DMEM高糖培养基,Gibco公司;大鼠表皮生长因子(EGF,80446-RNAE),Sino Biological公司;CCK-8试剂盒(GX805),日本同仁化学研究所;乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒,南京建成生物研究所;丙二醛(MDA)试剂盒,北京索莱宝生物科技公司;活性氧(ROS)试剂盒(S0033S),Beyotime公司;白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及HO-1 ELISA试剂盒,江苏菲亚/酶免实业有限公司;AnnexinV- FITC/PI试剂(KGA107),Keygen公司;Nrf2抗体(AF0639),affinity公司;锌原卟啉,MCE公司(49938);Nrf2、HO-1及内参β-actin引物,擎科生物科技公司;总RNA提取试剂盒(R6834-01),Omega Bio-Tek公司;QPCR试剂盒(KK4602),KAPA公司;反转录试剂盒(K1622),Invitrogen公司。

1.3主要仪器 BDS200倒置显微镜(南北仪器),3111型恒温培养箱(Thermo),Synergy H1全功能酶标仪(美国BioTeK),LightCycler 480实时荧光定量PCR仪(美国Roche),流式细胞仪(美国 BD FACSCelesta TM),NanoDrop2000 超微量分光光度计(Thermo)。

1.4实验方法

1.4.1细胞培养与分组 在含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、10 ng/mL EGF的DMEM培养基,37 ℃和5%CO2的条件下培养NRK-52E细胞,待细胞融合度达80%时进行消化、传代培养,取对数生长期的细胞用于实验。实验分为5组:正常对照组不加任何药,正常培养细胞;三七皂苷组加入三七皂苷R1培养细胞24 h;碘美普尔组加入碘美普尔400处理细胞5 h;三七皂苷+碘美普尔组先加入三七皂苷R1培养24 h,再用碘美普尔400处理细胞5 h;锌原卟啉组采用锌原卟啉与三七皂苷R1共培养24 h后,加入碘美普尔400处理细胞5 h。

1.4.2CCK-8法细胞活力检测 取对数生长期的NRK-52E细胞,以4×103个/孔接种96孔板,铺板过夜,6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L 的三七皂苷R1预处理NRK-52E细胞24 h,50 mgI/mL、100 mgI/mL、150 mgI/mL、200 mgI/mL、250 mgI/mL 碘美普尔400作用NRK-52E细胞5 h,去上清液,再加含10% CCK-8的培养液,以CCK-8工作液为阴性对照组,37 ℃孵育100 min,酶标仪450 nm波长读取吸光度(OD)值,取各组OD均值,NRK-52E细胞存活率=(OD实验-OD阴性对照)/(OD对照-OD阴性对照)×100%。根据细胞存活率,筛选三七皂苷R1和 碘美普尔400的最佳作用浓度。

1.4.3LDH法细胞损伤程度检测 待各组(除锌原卟啉组外)加药处理后,取上清液,按说明书操作,450 nm酶标仪读数。NRK-52E细胞LDH释放量(IU/L)=(OD测定-OD阴性对照)/(OD标准-OD阴性对照)×标准品浓度(0.2 mol/mL)×1 000。

1.4.4划痕实验细胞愈合率检测 待正常对照组、碘美普尔组、三七皂苷+碘美普尔组加药处理后,用10 μL移液器枪头垂直划痕,PBS洗去悬浮的细胞,各组加入含2%血清培养基培养48 h。使用倒置显微镜采集划痕0 h、48 h的图片,用Image J软件处理分析,记录各组的平均宽度H0、H1,细胞愈合率(%)= (H0-H1)/H0×100%。

1.4.5氧化应激指标含量检测 ①各组(除锌原卟啉组外)加药处理后,取上清液,按照操作说明书,采用 WST-1法检测SOD含量,采用硫代巴比妥酸法检测MDA含量。②各组(除锌原卟啉组外)加药处理后,弃上清,无血清培养基洗1次,计数取(1～2)×106/mL细胞,再用配制的DCFH-DA(10 μmol/L)重悬,孵育25 min,PBS洗3～4次,离心后PBS重悬待测,研究中设阳性对照组,荧光酶标仪检测,激发波488 nm、发射波525 nm,以荧光强度表示ROS含量。

1.4.6炎症因子含量检测 按2×105个/孔的细胞量接种6孔板,各组(除锌原卟啉组外)加药处理完,收集上清液,参照试剂盒说明书以ELISA法检测IL-6、TNF-α含量。

1.4.7流式细胞术细胞凋亡检测 按2×105个/孔的细胞量接种6孔板,正常对照组、碘美普尔组、三七皂苷+碘美普尔组按前述加药处理,非EDTA的胰酶消化,1 000 r/min离心4 min,重悬,计数取8×104细胞悬液,离心,PBS洗涤细胞1次(避免残留的培养基影响结果);根据Annexin V-FITC/PI试剂说明书操作,最后用流式细胞仪检测。

1.4.8Nrf2、HO-1 mRNA表达量检测 采用实时荧光定量PCR法检测:各组药物处理后弃上清,提取细胞总RNA,反转录成cDNA,qRT-PCR反应的具体操作按试剂说明书进行,用2-△△Ct法计算Nrf2、HO-1 mRNA相对表达量。Nrf2 上游引物序列为5’-GCCCTCAGCATGATGGACTTG-3’,下游引物序列为5’-TGGAGTTGCTCTTGTCTCCTCC-3’;HO-1上游引物序列为5’-AAGAGGCTAAGACCGCCTTC-3’,下游引物序列为5’-CCTCTGGCGAAGAAACTCTGT-3’;β-actin上游引物序列为5’-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3’,下游引物序列为5’-ATGCCACAGGATTCCATACC-3’。

1.4.9HO-1蛋白含量与Nrf2蛋白表达检测 ①各组加药处理后取上清液,采用ELISA法检测HO-1蛋白含量。②各组(除锌原卟啉组外,设不加Nrf2抗体阴性对照组)加药处理后弃上清,PBS洗3遍,加入4%多聚甲醛固定20 min。然后加入0.125% Triton X-100的PBS透膜10 min,200 μL封闭液室温封闭1 h后,加Nrf2抗体,4 ℃过夜孵育,PBS洗3次,加荧光二抗,室温避光孵育2 h,滴加DAPI染色液,染色5 min后,在激光共聚焦显微镜下观察并记录Nrf2蛋白表达情况,Image-Pro Plus 6.0处理分析图片。

1.5统计学方法 所有实验独立重复次数≥3次(3复孔/次),采用GraphPad Prism 5.0软件统计分析符合正态分布的数据,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用Dunnett、Bonferroni或Student-Newman-Keuls检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组细胞活力比较 与阴性对照组比较,不同浓度碘美普尔400组细胞存活率随碘美普尔400梯度浓度上调而下降,200 mgI/mL碘美普尔400处理细胞存活率约50%;不同浓度三七皂苷R1培养24 h后,25 μmol/L以下三七皂苷R1对细胞影响很小,而50 μmol/L时对细胞存活率影响较大。与单纯200 mgI/mL碘美普尔400处理细胞比较,加入不同浓度三七皂苷R1后细胞存活率均明显提高,25 μmol/L以下的三七皂苷R1对200 mgI/mL碘美普尔400所致NRK-52E细胞生长活力影响呈正相关,其中25 μmol/L 三七皂苷R1对碘美普尔400的预处理效果较优,而50 μmol/L 三七皂苷R1的效果则下降。综上,200 mgI/mL碘美普尔400培养5 h作为造模条件,25 μmol/L 三七皂苷R1预处理24 h作为最优三七皂苷R1用药条件。见图1。

图1 不同干预条件下NRK-52E细胞活力

2.2各组细胞损伤程度比较 三七皂苷组LDH释放量与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),碘美普尔组LDH释放量明显高于正常对照组和三七皂苷+碘美普尔组(P均<0.05)。见图2。

图2 各组NRK-52E细胞LDH释放量

2.3各组细胞愈合情况比较 碘美普尔组细胞愈合率明显低于正常对照组(P<0.05), 三七皂苷+碘美普尔组细胞愈合率明显高于碘美普尔组(P<0.05)。 见图3。

图3 各组NRK-52E细胞划痕实验细胞愈合情况

2.4各组细胞中氧化应激指标含量比较 三七皂苷组ROS、MDA、SOD含量与正常对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05) ;碘美普尔组ROS、MDA含量明显高于正常对照组(P均<0.05),SOD含量明显低于正常对照组(P<0.05);三七皂苷+碘美普尔组ROS、MDA含量明显低于碘美普尔组(P均<0.05),SOD含量明显明显高于碘美普尔组(P<0.05)。见图4。

图4 各组NRK-52E细胞中ROS、MDA、SOD含量

2.5各组细胞中炎症因子含量比较 三七皂苷组IL-6、TNF-α含量与正常对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05) ;碘美普尔组IL-6、TNF-α含量均明显高于正常对照组(P均<0.05),三七皂苷+碘美普尔组IL-6、TNF-α含量均明显低于碘美普尔组(P均<0.05)。见图5。

图5 各组NRK-52E细胞中IL-6、TNF-α含量

2.6各组细胞凋亡率比较 碘美普尔组细胞凋亡率明显高于正常对照组(P<0.05),三七皂苷+碘美普尔组细胞凋亡率明显低于碘美普尔组(P<0.05)。见图6。

图6 各组NRK-52E细胞凋亡率

2.7各组细胞中Nrf2、HO-1 mRNA表达量与蛋白表达情况比较 碘美普尔组Nrf2和HO-1 mRNA相对表达量、HO-1蛋白含量、Nrf2免疫荧光强度均明显低于正常对照组(P均<0.05),三七皂苷+碘美普尔组Nrf2和HO-1 mRNA相对表达量、HO-1蛋白含量、Nrf2免疫荧光强度均明显高于碘美普尔组(P均<0.05);锌原卟啉组Nrf2和HO-1 mRNA相对表达量、HO-1蛋白含量均明显低于三七皂苷+碘美普尔组(P均<0.05)。见图7。

图7 各组NRK-52E细胞中Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表达情况

3 讨 论

CI-AKI的发生与氧化应激失衡调控有密切联系。碘对比剂的渗透压及其直接的细胞毒性可致细胞缺氧、胞内ROS蓄积,致使氧化应激失衡［2］。外源性毒物或病理状态下,ROS过量可阻滞细胞周期,ROS响应细胞氧化应激,启动相关信号传导,推动细胞死亡机制的发展［11］。而SOD可清除自由基,保护细胞的重要成分,如脂质(磷脂)、DNA等［11］。本研究中,三七皂苷R1预处理使碘美普尔400所致NRK-52E细胞的SOD含量、细胞活力和细胞愈合率明显增高,LDH释放量及ROS、MDA表达明显较少,提示三七皂苷R1预处理可增强细胞抗氧化能力,减轻由碘美普尔400诱发ROS累积引起的脂质过氧化损伤,改善细胞的结构和功能,减轻细胞膜被碘美普尔400破坏的程度,从而限制由氧化应激触发级联通路导致的细胞死亡,提高细胞整体生存率。ROS介导细胞信号转导,诱发炎症反应［12］。炎症反应参与调控AKI期间肾脏细胞损伤和修复的病理生理过程,其中IL-6和TNF-α介导多类型AKI涉及的炎症免疫应答［13-14］。相关研究表明,调控炎性小体,限制TNF-α和IL-6等因子分泌,可减缓脓毒症AKI损伤［14］。本研究中,三七皂苷R1明显降低了碘美普尔400诱导的IL-6和TNF-α表达,说明三七皂苷R1通过增强NRK-52E细胞的抗氧化能力,及时限制过量ROS触发细胞炎症信号的传递,从而减缓细胞炎症的发展。

氧化自由基应激是凋亡的有效诱因,AKI的发生与肾小管上皮细胞凋亡的调控有密切关系［2,11］。本研究中,三七皂苷R1预处理使碘美普尔400所致NRK-52E细胞凋亡率明显下降,提示三七皂苷R1可改善由碘美普尔400引发的细胞凋亡或坏死情况,其机制可能是通过限制过多ROS产生,及时阻断ROS触发NRK-52E细胞的凋亡途径,最终抑制细胞的凋亡发展。

氧化应激或炎症可刺激促氧化剂血红素产生,而血红素可诱发大量自由基生成,并引起细胞级联氧化应激,导致细胞损伤;细胞为了维持稳态,常通过促进内源性HO-1迅速表达来分解血红素,从而抵抗自由基损伤［15-17］。而据近年研究显示,Nrf2是介导HO-1发挥作用的关键转录因子,它介导的抗氧化酶或相关抗氧化基因是抑制氧化应激,减缓凋亡的重要因素,被誉为肾脏保护很有前途的防御靶点［15］。本研究中,三七皂苷R1预处理使碘美普尔400诱导NRK-52E细胞中Nrf2、HO-1的mRNA 和蛋白表达增加,但加抑制剂锌原卟啉后,二者表达显著降低,暗示三七皂苷R1可特异性地促进NRK-52E细胞中Nrf2及HO-1的表达,明显逆转碘美普尔400诱导时的低表达状态。综上考虑,三七皂苷R1通过激活Nrf2/HO-1途径,来调控NRK-52E细胞抵御碘美普尔400所致的氧化、炎症及凋亡损伤。

Nrf2是CI-AKI的潜在治疗靶标,三七皂苷R1具有显著抗氧化、抑炎、减缓细胞凋亡的潜在临床价值,是防御肾脏疾病比较有前景的候选天然药物。本研究为防治非螯合剂碘对比剂导致的CI-AKI提供了基础资料,为进一步开发、利用中草药三七奠定了基础,为研制出药理作用机制确切、质量可控、疗效显著的三七皂苷R1药品或相关产品提供了一定的参考依据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。