MEBT/MEBO对糖尿病大鼠难愈合创面中ZEB1/LAMA3/ITGA3信号通路表达的影响

黄金梅,唐 婷,韦柳叶,左远娟,贺佐分,龚元勋,姜 艳,郭文闻,谭 奔,唐乾利,

(1. 广西中医药大学研究生院,广西 南宁 530200;2. 右江民族医学院研究生学院,广西 百色 533000;3. 右江民族医学院附属医院,广西 百色 533000;4. 右江民族医学院/桂西高发病防治重点实验室,广西 百色 533000)

糖尿病引发创面难愈合的现象非常普遍,常导致残疾甚至死亡［1-2］。糖尿病难愈合创面的病因复杂,即使愈合后亦会复发［3］。其治疗问题在患者健康和经济方面都变得繁重,因此创面修复、皮肤再生仍是一个重要的公共卫生问题和挑战［4］。皮肤再生医疗技术立足于中西医结合理论,强调原位再生,秉承整体观念,具有显著的止痛、抗感染、促进创面愈合、减少瘢痕等作用。唐乾利教授课题组从宏观到微观系统阐述了该技术治疗慢性难愈合创面的作用靶点［5-6］,但对创面表皮再上皮化机制仍知之甚少。据研究发现,细胞外基质(ECM)的层黏连蛋白3(LAMA3)与角质形成细胞的整合素α3(ITGA3)结合可调节细胞黏着、迁移等［7］。E盒结合锌指蛋白(ZEB)家族成员ZEB1可直接调节LAMA3的表达,影响细胞的活动［8］。而ZEB1/LAMA3/ITGA3信号通路是否在糖尿病难愈合创面修复中起到作用,皮肤再生医疗技术对此信号通路是否有调节作用,其背后的机制尚未明确。故本实验采用湿润暴露疗法/湿润烧伤膏(MEBT/MEBO)干预糖尿病大鼠难愈合创面,基于ZEB1/LAMA3/ITGA3信号通路探讨了该疗法对创面表皮区再上皮化的作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级Wistar雄性大鼠80只,12周龄,体重200～250 g,购自长沙市天勤生物技术有限公司,许可证号:SCXK(湘)2019-0013。严格遵照右江民族医学院实验动物伦理委员会标准,于SPF级动物房饲养。室温20～26 ℃,相对湿度 45%～55%,昼夜循环,保持12 h光照,分笼饲养,自由饮食饮水。

1.2主要仪器与试剂 自动脱水机(型号:Excelsior AS,江苏维林科生物技术有限公司),包埋机(型号:HistoStarTM,江苏维林科生物技术有限公司),切片机(型号:HM325,北京恒三江仪器销售有限公司),共聚焦显微镜(型号:STELLARIS 5,徕卡显微系统贸易有限公司),荧光定量PCR(型号:LightCycler 96,上海微速生物科技有限公司);MEBO(汕头市美宝制药有限公司,国药准字Z20000004);贝复新(珠海亿胜生物制药有限公司,国药准字S20040001);链脲佐菌素(STZ)、HE、Masson试剂(北京索莱宝科技有限公司);LAMA3 antibody(武汉博欧特生物科技有限公司);二抗(赛默飞世尔科技有限公司);LAMA3 、ITGA3、ZEB1引物(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.3实验方法 大鼠适应性喂养7 d后,随机抽取18只作为急性创面组,其余62只腹腔注射STZ制备糖尿病创面模型。糖尿病造模方法参考文献［9］:大鼠禁食12 h,采用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 4.2)将STZ稀释成1%的溶液,按照50 mg/kg左下腹腔快速注射,急性创面组腹腔注射同等剂量缓冲液。连续注射3 d后,以空腹血糖≥16.7 mmol/L为标准;若模型不成功,再次禁食12 h后,补充1% STZ溶液10 mg/kg同法注射。创面造模方法参考文献［10］:糖尿病造模成功后,根据全层皮肤缺损法和沈氏改良塑料环肉芽肿定量法制备创面模型。固定大鼠四肢,将其背部朝上,先剃去背部毛发,再以脱毛膏脱毛,为消除脱毛剂对皮肤的影响,用清水洗涤并擦干背部皮肤。脱毛24 h后,通过小动物麻醉机让大鼠吸入2.5%异氟烷麻醉,在无菌条件下,沿脊椎方向用外科方法做2条深达筋膜、直径为30 mm的圆形全层皮肤缺损创面。将糖尿病创面造模成功54只大鼠(剩余大鼠作为本实验同批次糖尿病大鼠备选)随机分为MEBT/MEBO组、贝复新组、糖尿病创面组,每组18只。各组大鼠开始换药干预,每日2次。换药前均以1/5 000呋喃西林液清洁创面,MEBT/MEBO组外敷2层MEBO纱条(0.2 g/cm2),贝复新组外敷2层贝复新浸透纱布(60 IU/cm2),糖尿病创面组和急性创面组外敷2层生理盐水纱布,然后均外用胶布“丰”形固定2层消毒干纱布。

1.4创面组织取材方法 各组于造模后第3,7,14天分别随机取6只大鼠麻醉,从深筋膜下层切取距离创缘0.5 cm的整个创面。将标本无张力地平展在滤纸上,小心把标本对半切开,一半用称量纸包裹固定形状后放入10%的中性缓冲液福尔马林中,24 h后再放入70%的酒精中,置于4 ℃冰箱。另外一半置于冻存管中,放入液氮中-80 ℃保存。

1.5检测指标及方法

1.5.1创面愈合情况 拍摄每组大鼠造模后当天及第3,7,14天创面图片,通过Image J软件计算创面面积,按照公式计算创面愈合率［创面愈合率=(初始创面面积-所拍照时间点创面面积)/初始创面面积×100%］。

1.5.2创面组织病理形态 将福尔马林处理后的组织放于自动化脱水仪器脱水后进行包埋,切片厚度为4 μm,进行2个二甲苯循环脱蜡透明,每步10 min;接着以无水乙醇5 min-无水乙醇5 min-90%乙醇5 min-80%乙醇5 min-70%乙醇5 min-纯水5 min进行组织水化;分别进行HE染色、Masson染色;最后进行乙醇脱水、二甲苯透明,中性树脂封片,显微镜下分析。

1.5.3创面组织中LAMA3蛋白阳性表达情况 取制备好的组织切片,按常规方法脱蜡至水,经柠檬酸盐抗原修复液修复后,滴加驴血清,室温封闭1 h。滴加LAMA3一抗(比例1∶50)于切片样本上,并将切片放于湿盒中,4 ℃冰箱过夜。孵育二抗前进行洗片3次,每次10 min;滴加二抗(比例1∶500),常温下1 h,敷二抗后均避光操作。再次洗片3次,每次10 min,DAPI常温下染色8 min,洗片3次,每次5 min,最后用50%甘油封片。共聚焦显微镜下观察,并使用Image J分析结果。

1.5.4创面组织中LAMA3、ITGA3、ZEB1mRNA表达情况 取适量冻存创面组织,按说明书1∶10比例添加Trizol裂解液,提取组织总RNA。在冰上使用高压消毒后的剪刀将浸没在裂解液中的组织剪碎,接着将组织放入全自动样品快速研磨仪中研磨2 min;先后加入200 μL氯仿、0.5 mL异丙醇,期间12 000 r/min离心收取上清液。添加75%乙醇进行纯化,接着用DEPC水溶解RNA,紫外可见分光光度计测定其浓度,放于-80 ℃ 冰箱待用。采用BeyoRTTMII cDNA第一链合成试剂盒(RNase H-)反转录操作,20 μL反转录体系中反转录合成cDNA。依照HieffTMqPCR SYBR Green Master Mix进行操作,采用荧光定量PCR仪,根据2-△△Ct法分析数据的相对定量。引物序列:ITGA3上游为5’-GGGTGCCGTCTATGTCT-3’,下游为5’-TCTCCGTGGATTATCTGCT-3’;LAMA3上游为5’-GCGAACCAACACCCTCCT-3’,下游为5’-CACCGACACTGATGTCCTTTAT-3’;ZEB1上游为5’-AAAGTGGCTGTAGATGGTA-3’,下游为5’-ACTCACGGCTTCTTGCTC-3’;GAPDH上游为5’-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3’,下游为5’-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’。

1.6统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行数据统计分析。计量资料满足正态分布且方差齐,多组间比较采用单因素分析,两两比较采用LSD检验;若方差不齐,采用盖姆斯-豪厄尔(A)法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组创面愈合情况 造模后第3天,急性创面组大鼠创面润泽,糖尿病创面组大鼠创面色泽略显晦暗,各组创面愈合率比较差异无统计学意义(P均>0.05)。造模后第7天,糖尿病创面组创面稍大且存在分泌液,边界模糊,表面覆盖较厚的暗红色组织物;MEBT/MEBO组、贝复新组和急性创面组大鼠创面边界清晰,面积缩小,创面愈合率均明显高于糖尿病创面组(P均<0.05),MEBT/MEBO组创面愈合率与贝复新组比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模后第14天,糖尿病创面组创面明显缩小,较之前干燥,边缘清晰,但仍有少许分泌物;MEBT/MEBO组、贝复新组和急性创面组大鼠创面均明显缩小,创面愈合率均明显高于糖尿病创面组(P均<0.05),MEBT/MEBO组创面愈合率与贝复新组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1及图2。

图1 急性创面组和糖尿病创面各组大鼠造模后不同时间点创面愈合情况

图2 急性创面组和糖尿病创面各组大鼠造模后不同时间点创面愈合率

2.2各组创面组织HE染色病理形态 造模后第3天,各组大鼠创面组织中均存在明显炎症细胞和红细胞浸润,创面边缘的表皮层增厚。造模后第7天,糖尿病创面组大鼠创面组织中炎性细胞较多,虽然边缘表皮增厚,但形成的表皮向创面迁移长度较短;MEBT/MEBO组、贝复新组和急性创面组大鼠创面均出现散在的肉芽组织,炎症浸润减轻,边缘表皮增厚并明显向创面中心迁移。造模后第14天,糖尿病创面组大鼠创面炎症细胞浸润减轻,但表皮再上皮化尚未完全;MEBT/MEBO组、贝复新组和急性创面组大鼠部分创面的表皮覆盖完全,并生成毛囊胚、皮脂腺、血管等。见图3。

图3 急性创面组和糖尿病创面各组大鼠造模后不同时间点创面组织HE染色表现(×200)

2.3各组创面组织Masson染色情况 造模后第3天,各组大鼠创面组织中胶原纤维细小,红细胞较多。造模后第7天,糖尿病创面组大鼠创面组织中胶原纤维染色较少且分布不均匀;MEBT/MEBO组、贝复新组、急性创面组大鼠创面组织中均可见分布和排列均匀的胶原纤维,同时有血管新生。造模后第14天,糖尿病创面组大鼠创面组织中有少量胶原纤维,且呈稀疏结构;MEBT/MEBO组、贝复新组、急性创面组大鼠创面组织中存在明显增多且粗大、密集分布的胶原纤维。见图4。

图4 急性创面组和糖尿病创面各组大鼠造模后不同时间点创面组织Masson染色表现(×200)

2.4各组创面组织中LAMA3蛋白阳性表达情况LAMA3蛋白分布在表皮层与真皮层之间,表达于向创面中心迁移的新生基底膜中,在创面边缘远端的正常皮肤结构中的基底膜几乎不表达。糖尿病创面组第3,7,14天创面组织中LAMA3蛋白阳性表达光密度值均明显低于其他组(P均<0.05),MEBT/MEBO组与贝复新组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图5及图6。

图5 急性创面组和糖尿病创面各组大鼠造模后不同时间点创面组织中LAMA3蛋白阳性表达情况(免疫荧光染色,×200,×800)

图6 急性创面组和糖尿病创面各组大鼠造模后不同时间点创面组织中LAMA3蛋白阳性表达光密度值

2.5各组创面组织中LAMA3、ITGA3、ZEB1 mRNA 表达情况 造模后第3,7,14天,糖尿病创面组创面组织中LAMA3、ITGA3 mRNA表达量均明显低于其他组(P均<0.05),ZEB1 mRNA表达量均明显高于其他组(P均<0.05),MEBT/MEBO组创面组织中LAMA3、ITGA3、ZEB1 mRNA表达量与贝复新组比较差异均无统计学意义(P均>0.05);MEBT/MEBO组中LAMA3、ITGA3、ZEB1 mRNA表达量与贝复新组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图7。

图7 急性创面组和糖尿病创面各组大鼠创面组织中LAMA3 、ITGA3、ZEB1mRNA相对表达量

3 讨 论

糖尿病患者易合并糖尿病足部溃疡等难愈合创面病变,且常出现再上皮化功能障碍,并加快创面病理学进程［3］。研究表明,创面中的细胞常以角质形成细胞为主导,在伤口基质上持续迁移,以密封表皮断层、恢复表皮结构和屏障功能,创面再上皮化被用作评估伤口愈合的参数［11-12］。课题组前期研究发现,MEBT/MEBO能够通过作用于角质形成细胞,进而加快创面的愈合,但是其具体作用机制仍不明确。

现有研究发现,LAMA3和ITGA3是皮肤创面愈合的关键调节因子,可使参与再上皮化的角质形成细胞沿着富含纤维蛋白/层黏连蛋白的ECM向创面中心迁移［7,13-14］。ECM是组成细胞外微环境的基础,对细胞迁移、增殖、凋亡等有重要调控作用,其重塑在创面愈合中具有促进再上皮化和血管新生等作用［15］。故本研究从角质形成细胞促进创面愈合的机制开展研究,旨在为治疗糖尿病难愈合创面提供理论依据。

本实验结果显示,造模后第7,14天,糖尿病创面组创面愈合率均明显低于其他组;造模后第14天,病理观察显示糖尿病创面组创面仍有炎症浸润,表皮再上皮化不全,创面组织中LAMA3蛋白表达光密度值和LAMA3、ITGA3mRNA表达量均明显低于其他组。提示LAMA3、ITGA3的表达与再上皮化有关,二者在糖尿病难愈合创面中表达减少,与文献［16-17］实验结果一致。MEBT/MEBO组LAMA3蛋白表达光密度值和LAMA3、ITGA3mRNA表达量与急性创面组、贝复新组比较差异均不明显,提示MEBT/MEBO能上调创面组织中LAMA3和ITGA3表达。

ZEB1被认为是肿瘤细胞的上皮-间质转化转录激活剂,其可直接调节LAMA3的表达,从而影响再上皮化进程［11］;可减弱角质形成细胞黏附作用,并阻止其向创面中心定向迁移,影响再上皮化,导致表皮屏障的完整性受损［16-18］。ZEB1还可以血糖状态依赖的方式调控创面血管的生成和闭合,适度的表达可促进创面血管生成,极端过表达则可导致血管内皮功能丧失和持续性炎症反应［19-20］。本实验结果显示,糖尿病创面组创面组织中ZEB1 mRNA表达量高于急性创面组、MEBT/MEBO组和贝复新组;病理观察显示糖尿病创面组的创面边缘表皮增厚但迁移较慢,且创面持续炎症浸润,新生血管少,这可能与该组ZEB1表达失衡有关。急性创面组、MEBT/MEBO组和贝复新组创面组织出现新生血管,胶原纤维排列有序,表皮迁移较快,提示MEBT/MEBO可下调ZEB1表达,促进创面血管新生和再上皮化。

综上,糖尿病大鼠难愈合创面再上皮化迟缓,可能与ZEB1表达过高,从而影响与创面细胞黏附、定向迁移相关的LAMA3、ITGA3表达不足有关;MEBT/MEBO干预可上调LAMA3、ITGA3表达,相对下调ZEB1表达,以创造良好的愈合组织微环境,促进再上皮化。但因再上皮化修复机制的复杂性、重叠性,同时ZEB1仅在肿瘤、癌症领域研究较多,ZEB1/LAMA3/ITGA3信号通路在创面修复的相关研究仍需更深入的探讨。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。