东紫苏化学成分及其抗炎活性研究

杨 刚，崔小燕，张佳雄，陈态明，刘亚平，王易芬, 4

东紫苏化学成分及其抗炎活性研究

杨 刚1，崔小燕2#，张佳雄3，陈态明3，刘亚平3*，王易芬1, 4*

1. 云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500 2. 昆明医科大学海源学院，云南 昆明 650106 3. 昆明理工大学食品科学与工程学院，云南 昆明 650500 4. 中国科学院昆明动物研究所，云南 昆明 650201

对东紫苏全株的化学成分及其抗炎活性进行研究。采用正相硅胶色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱、ODS柱色谱、高效液相色谱等技术进行分离纯化，根据核磁共振、质谱等波谱数据结合文献数据鉴定化合物结构。通过检测脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的RAW 264.7巨噬细胞中炎症因子白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表达和一氧化氮（NO）的抑制能力，评价所分离化合物的抗炎活性。从东紫苏全株的醋酸乙酯部位分离得到19个单体化合物，包括7个黄酮、5个倍半萜、3个三萜、3个甾体及1个苯丙素类化合物，结构分别鉴定为芹菜素（1）、木犀草素（2）、白杨素（3）、木犀草素-7β葡萄糖苷（4）、圣草酚（5）、乔松素（6）、semecarpanone（7）、咖啡酸乙烯酯（8）、oplodiol（9）、lβ,4β,6βtrihydroxyeudesmane（10）、1β,10α,4β,5α-diepoxy-7α-germacran-6β-ol（11）、teucladiol（12）、caryolane-1,9β-diol（13）、齐墩果酸（14）、乌苏酸（15）、坡模酸（16）、5α,8α-环二氧-24()-甲基麦角甾-6,22-二烯-3β-醇（17）、β-谷甾醇（18）、豆甾醇（19）。从东紫苏中分离获得19个单体化合物，其中化合物7、9～13、17首次从该属植物中分离得到。化合物1、4、9、12～14、17～19能显著降低LPS诱导的巨噬炎症细胞中NO的释放以及抑制炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌，具有较好的体外抗炎活性。

东紫苏；分离鉴定；LPS诱导；抗炎活性；炎症因子；semecarpanone；oplodiol；5α,8α-环二氧-24()-甲基麦角甾-6,22-二烯-3β-醇

东紫苏Vaniot别名凤尾茶、小山茶、云松茶、小香薷等，为唇形科（Labiatae）香薷属Willd.多年生草本植物，高25～30 cm，主要分布在云南、贵州和四川等地，全草皆可入药，可治外感风寒、虚火牙痛、消化不良等症状，亦可当茶饮，具有清热解毒之功效[1]。现代药理研究也表明，东紫苏具有显著的抗氧化、抗流感以及抗疲劳等作用[2-4]，其化学成分主要为黄酮类、三萜类、酚类以及挥发油类成分等[5]，仅有少量文献报道了萜类化合物的抗炎活性[6]。东紫苏的这些功效均与民间用途相关，进一步解析东紫苏的化学组成以及传统用途，对东紫苏进行化学成分和抗炎活性研究，寻找其抗炎活性成分。本研究从东紫苏全株中分离鉴定了19个单体化合物，运用核磁共振技术（NMR）与质谱（MS）等波谱数据结合文献报道数据鉴定了19个单体化合物的结构，分别为芹菜素（apigenin，1）、木犀草素（luteolin，2）、白杨素（chrysin，3）、木犀草素-7β葡萄糖苷（luteolin-7βglucoside，4）、圣草酚（eriodictyol，5）、乔松素（pinocembrin，6）、semecarpanone（7）、咖啡酸乙烯酯（caffeic acid ethylene ester，8）、oplodiol（9）、lβ,4β,6βtrihydroxyeudesmane（10）、1β,10α,4β,5α-diepoxy-7α-germacran-6β-ol （11）、teucladiol（12）、caryolane-1, 9β-diol（13）、齐墩果酸（oleanelic acid，14）、乌苏酸（ursolic acid，15）、坡模酸（pomolic acid，16）、5α,8α-环二氧-24()-甲基麦角甾-6,22-二烯-3β-醇 [5α,8α-epidioxy-24()- methylergosta-6,9(11),22- trien-3β-ol，17]、β-谷甾醇（β-sitoster，18）、豆甾醇（stigmasterol，19）。化合物1～7为黄酮类化合物，9～13为倍半萜类化合物，14～16为三萜类化合物，17～19为甾体类化合物，8为苯丙素类化合物，其中7、9～13、17首次从该属植物中分离得到。利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠巨噬细胞建立体外炎症模型，探讨东紫苏单体化合物的抗炎活性。结果表明，化合物1、4、9、12～14、17～19能显著降低LPS诱导的巨噬炎症细胞中NO的释放以及显著抑制炎症因子白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、IL-1β和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的分泌，抑制效果优于阳性对照地塞米松，显示出较好的抗炎活性。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

柱色谱硅胶（200～300目）购自青岛谱科分离材料有限公司。Bruker AV-400和DRX-500超导核磁共振仪，TMS作为内标。Waters 600半制备型高效液相色谱仪和Shimadzu SIL-20A型制备型高效液相色谱仪，两者均是双波长紫外检测器，色谱柱为COSMOSILRP-C18（250 mm×10 mm，5 µm，COSMOSIL，日本），Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（瑞典乌普拉萨公司），YMC凝胶由日本YMC有限公司生产，反相硅胶填料RP-18购自日本FUJI公司，显色剂为10%的硫酸乙醇溶液。NO试剂盒（南京建成生物工程研究所），MTT（sigma-Aldrich，上海），LPS（北京Solarbio公司），TNF-α、IL-6和IL-1β试剂盒（MultiSciences Biotech公司，杭州），阳性对照地塞米松（批号D1001A，大连美仑生物技术有限公司）。乙腈为色谱级（美国Merck公司），其余工业级溶剂均重蒸后使用。

1.2 材料

实验用东紫苏于2020年11月购买于云南鸿翔一心堂药业（集团）股份有限公司，由昆明理工大学刘亚平副教授鉴定为东紫苏Vaniot的全株，植物标本（Liu20201103）存放于昆明理工大学食品科学与工程学院。

2 方法

2.1 提取与分离

将东紫苏全株（5.0 kg）粉碎，加入80%甲醇回流提取4次，每次4 h，减压浓缩回收溶剂至无醇味，得到甲醇的粗提取物674 g。向醇提取物中加入适量的水和醋酸乙酯，搅拌均匀，萃取3次得到醋酸乙酯层，观察到水层有化合物析出，运用滤过离心等纯化手段得到化合物4（43 g），将醋酸乙酯层减压浓缩得到浸膏246 g。用硅胶色谱柱粗分，用氯仿-甲醇（1∶0～0∶1）进行梯度洗脱，经薄层色谱（TLC）追踪检测得到5个馏份Fr. I～V。

Fr. I（20 g）首先用中压柱MCI分离，用溶剂甲醇-水（8∶2～10∶0）洗脱得到2个馏份Fr. Ia和Fr. Ib。Fr. Ia用硅胶分离，用石油醚醋酸乙酯（50∶1～10∶1）梯度洗脱得到19（17 mg），重结晶得到化合物18（100 mg），剩下成分属于色素挥发油成分。

Fr. II（50 g）首先用中压柱MCI分离，用溶剂甲醇-水（8∶2～10∶0）洗脱得到3个馏份Fr. II（a～c），Fr. II a用硅胶分离，经过石油醚-醋酸乙酯（30∶1）等度洗脱得到化合物14（4 mg），Fr. II b用硅胶分离，用石油醚-醋酸乙酯（20∶1～10∶1）梯度洗脱，得到化合物15（3 mg）。Fr. II c通过正相硅胶色谱分离和半制备高效液相纯化得到化合物12（4 mg，R＝9.0 min；乙腈-水75∶25，3.0 mL/min）和化合物16（20 mg，R＝17.5 min；乙腈-水75∶25，3.0 mL/min）。

Fr. III（40 g）首先用中压柱MCI分离，用溶剂甲醇-水（7∶3～10∶0）洗脱得到3个馏份Fr. III（a～c），Fr. Ⅲ a用硅胶分离，用石油醚醋酸乙酯体系梯度洗脱得到化合物17（19 mg），Fr. III b用Sephadex LH-20以氯仿-甲醇（1∶1）分离得到化合物6（80 mg）。Fr. III c采用正向色谱柱洗脱，用氯仿-甲醇（50∶1～40∶1）梯度洗脱得到化合物10（5 mg），再经半制备高效液相纯化得到化合物11（20 mg，R＝7.0 min；乙腈-水67∶33，3.0 mL/min）和9（4 mg，R＝10.0 min；乙腈-水67∶33，3.0 mL/min）。

Fr. IV（35.2 g）首先用中压柱YMC柱加压分离，用甲醇-水（4∶6～0∶10）洗脱得到4个馏份Fr. IV（a～d），Fr. IV a用正相硅胶进行分离，有晶体析出，为化合物5（30 mg）。Fr. IV b用Sephadex LH-20凝胶柱，以氯仿-甲醇（1∶1）分离得到化合物7（23 mg）。Fr. IV c用正相硅胶进行分离得到化合物3（7 mg）和亚馏份Fr. IV c1，将Fr. IV c1采用半制备高效液相纯化得到化合物8（4 mg，R＝8.0 min；乙腈-水56∶44，3.0 mL/min）与13（8 mg，R＝14.5 min；乙腈-水56∶44，3.0 mL/min）。

Fr. V（12.9 g）采用硅胶划段，用氯仿-甲醇（10∶1～0∶1）梯度洗脱，TLC追踪监测得到2个馏份Fr. V（a～b），Fr. Va用正相硅胶进行分离，再经Sephadex LH-20分离得到化合物1（92 mg），Fr. Vb用中压柱YMC分离，洗脱剂为甲醇-水（30∶70）得到化合物2（20 mg）。

2.2 体外抗炎活性评价

按照文献方法[7]，将RAW 264.7巨噬细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板上，在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h。本实验设置对照组、LPS诱导组、阳性对照地塞米松（dexamethasone，DEX）组和实验组，阳性对照组和实验组均以20 μg/mL待测的单体化合物1～19或DEX加入到处理好的RAW 264.7巨噬细胞中。放置4 h后在对照组加入10 μL的培养基，其余组加入LPS（1.0 μg/mL）用以诱导细胞，培养孵育24 h，离心，收集细胞上层清液，通过酶联免疫吸附法（ELISA）测定NO的释放量，然后优选出具有较好抑制活性的化合物。然后再重复上述实验过程，测定RAW 264.7巨噬细胞中炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的表达量。应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色（MTT）法检测化合物在20 μg/mL对RAW 264.7巨噬细胞生长的影响。

3 结构鉴定

化合物1：黄色粉末，ESI-MS/: 269 [M－H]−，分子式为C15H10O5。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 12.97 (1H, s, 5-OH), 10.58 (1H, brs, 7-OH), 7.93 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2, 6), 6.93 (2H, d,= 8.4 Hz, H-3, 5), 6.79 (1H, s, H-3), 6.49 (1H, d,= 1.6 Hz, H-8), 6.20 (1H, d,= 1.6 Hz, H-6)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-6): 164.2 (C-2), 102.8 (C-3), 181.7 (C-4), 161.4 (C-5), 98.8 (C-6), 163.2 (C-7), 93.9 (C-8), 157.3 (C-9), 103.7 (C-10), 121.1 (C-1), 128.4 (C-2, 6), 115.9 (C-3, 5), 161.2 (C-4)，以上数据经查阅文献报道[8]，鉴定化合物1为芹菜素。

化合物2：黄色粉末，ESI-MS/: 287 [M＋H]+，分子式为C15H10O6。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 12.96 (1H, s, 5-OH), 7.41 (1H, d,= 8.4 Hz, H-6), 7.38 (1H, brs, H-2), 6.88 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5), 6.65 (1H, s, H-3), 6.43 (1H, d,= 2.4 Hz, H-8), 6.17 (1H, d,=2.4 Hz, H-6)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 163.9 (C-2), 102.8 (C-3), 180.6 (C-4), 161.4 (C-5), 98.8 (C-6), 164.2 (C-7), 93.8 (C-8), 157.3 (C-9), 103.6 (C-10), 121.5 (C-1), 113.3 (C-2), 145.7 (C-3), 149.7 (C-4), 116.0 (C-5), 119.0 (C-6)。以上数据经查阅文献报道[9]，鉴定化合物2为木犀草素。

化合物3：淡黄色粉末，ESI-MS/: 253 [M－H]−，分子式为C15H10O4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 12.79 (1H, s, 5-OH), 10.88 (1H, s, 7-OH), 8.01 (2H, d,= 6.8 Hz, H-2′, 6′), 7.53 (3H, m, H-3′, 4′, 5′), 6.91 (1H, s, H-3), 6.48 (1H, d,= 1.6 Hz, H-8), 6.20 (1H, d,= 1.6 Hz, H-6)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 157.4 (C-2), 105.1 (C-3), 181.8 (C-4), 161.4 (C-5), 99.0 (C-6), 164.4 (C-7), 94.1 (C-8), 163.1 (C-9), 105.9 (C-10), 130.7 (C-1′), 126.3 (C-2′, C-6′), 129.1 (C-3′, C-5′), 131.9 (C-4′)。以上数据经查阅文献[10]，鉴定化合物3为白杨素。

化合物4：淡黄色粉末，ESI-MS/: 447 [M－H]−，分子式为C21H20O11。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 12.98 (1H, s, 5-OH), 9.68 (1H, s, 3′-OH), 7.43 (1H, dd,= 8.4, 1.6 Hz, Hz-6′), 7.21 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2′), 6.88 (1H, d,= 8.4 Hz, H-5′), 6.77 (1H, d,= 1.6 Hz, H-8), 6.75 (1H, s, H-3), 6.42 (1H, d,= 1.6 Hz, H-6), 5.06 (1H, d,= 6.0 Hz, Glc-H-1), 3.40～3.10 (6H, overlapped, Glc-H-2～5, 6a, 6b)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 162.9 (C-2), 105.3 (C-3), 181.9 (C-4), 161.1 (C-5), 99.5 (C-6), 164.4 (C-7), 94.6 (C-8), 156.9 (C-9), 103.1 (C-10), 121.3 (C-1′), 113.5 (C-2′), 145.8 (C-3′), 149.9 (C-4′), 115.9 (C-5′), 119.1 (C-6′), 99.8 (Glc-C-1), 73.0 (Glc- C-2), 76.3 (Glc-C-3), 77.1 (Glc-C-4), 69.4 (Glc-C-5), 60.5 (Glc-C-6)。以上数据经查阅文献报道[11]，鉴定化合物4为木犀草素-7β葡萄糖苷。

化合物5：黄色粉末，ESI-MS/: 289 [M＋H]+，分子式为C15H12O6。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 12.4 (1H, s, 5-OH), 9.04 (2H, s, 3, 4-OH), 6.87 (1H, brs, H-2), 6.74 (1H, d,= 8.0 Hz, H-6), 6.72 (1H, d,= 8.0 Hz, H-5), 5.88 (1H, d,= 2.4 Hz, H-8), 5.87 (1H, d,= 2.4 Hz, H-6), 5.38 (1H, dd,= 10.0, 2.4 Hz, H-2), 3.18 (1H, dd,= 14.0, 10.0 Hz, H-3a), 2.67 (1H, dd,= 14.0, 2.4 Hz, H-3b)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 78.4 (C-2), 42.0 (C-3), 196.3 (C-4), 163.4 (C-5), 95.7 (C-6), 165.6 (C-7), 94.9 (C-8), 162.9 (C-9), 101.7 (C-10), 129.4 (C-1), 114.3 (C-2), 145.7 (C-3), 145.2 (C-4), 115.3 (C-5), 117.9 (C-6)。以上数据经查阅文献报道[12]，鉴定化合物5为圣草酚。

化合物6：白色针状结晶（甲醇），ESI-MS/: 257 [M－H]−，分子式为C15H12O4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 12.11 (1H, s, 5-OH), 7.51～7.37 (5H, m, H-2～6), 5.91 (1H, d,= 1.6 Hz, H-6), 5.89 (1H, d,= 1.6 Hz, H-8), 5.57 (1H, dd,= 12.4, 3.8 Hz, H-2), 3.16 (1H, dd,= 16.0, 12.4 Hz, H-3a), 2.77 (1H, dd,= 16.0, 3.8 Hz, H-3b)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 78.3 (C-2), 42.1 (C-3), 195.9 (C-4), 162.7 (C-5), 95.1 (C-6), 166.9 (C-7), 95.9 (C-8), 163.5 (C-9), 101.7 (C-10), 138.7 (C-1), 126.6 (C-2, 6), 128.5 (C-3～5)。以上数据经查阅文献报道[13]，鉴定化合物6为乔松素。

化合物7：黄色粉末，ESI-MS/: 597 [M－H]−，分子式为C30H30O13。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d): 12.01 (2H, s, 5-OHⅠ, 5-OHⅡ), 5.85 (2H, dd,= 2.4, 1.6 Hz, H-6Ⅰ, 6Ⅱ), 5.82 (1H, d,= 2.0 Hz, H-8Ⅱ), 5.78 (1H, d,= 2.6 Hz, H-8Ⅰ), 4.89 (1H, m, H-2Ⅰ), 4.64 (1H, m, H-2Ⅱ), 3.57 (6H, s, 1-OMeⅠ, 1-OMeⅡ), 3.37 (2H, m, H-3Ⅰ,3Ⅱ), 2.89 (4H, m, H-3Ⅰ,3Ⅱ), 2.73 (4H, m, H-2Ⅰ,2Ⅱ), 2.26 (3H, s, H-5Ⅰ-CH3), 2.23 (3H, s, H- 5Ⅱ-CH3)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-d): 76.0 (C-2Ⅰ), 38.6 (C-3Ⅰ), 195.8 (C-4Ⅰ), 101.6 (C-4aⅠ), 162.2 (C-5Ⅰ), 96.0 (C-6Ⅰ), 163.4 (C-7Ⅰ), 94.8 (C-8Ⅰ), 166.5 (C-8aⅠ), 172.2 (C-1Ⅰ), 29.9 (C-2Ⅰ), 51.0 (C-3Ⅰ), 208.0 (C-4Ⅰ), 31.2 (C-5Ⅰ), 51.7 (1-OMe), 77.0 (C-2Ⅱ), 38.3 (C-3Ⅱ), 195.3 (C-4Ⅱ), 101.6 (C-4aⅡ), 162.1 (C-5Ⅱ), 96.1 (C-6Ⅱ), 163.4 (C-7Ⅱ), 94.8 (C-8Ⅱ), 166.5 (C-8aⅡ), 171.8 (C-1Ⅱ), 31.3 (C-2Ⅱ), 51.0 (C-3Ⅱ), 206.9 (C-4Ⅱ), 29.4 (C-5Ⅱ), 51.5 (1-OMe)。以上数据经查阅文献报道[14]，鉴定化合物7为semecarpanone。

化合物8：淡黄色粉末，ESI-MS/: 207 [M＋H]+，分子式为C11H10O4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 7.63 (1H, d,= 12.8 Hz, H-7), 7.34 (1H, dd,= 4.8, 1.2 Hz, H-10), 7.11 (1H, d,= 1.6 Hz, H-2), 7.07 (1H, dd,= 6.4, 1.6 Hz, H-6), 6.78 (1H, d,= 6.4 Hz, H-5), 6.34 (1H, d,= 12.8 Hz, H-8), 4.87 (1H, dd,= 11.2, 1.2 Hz, H-11a), 4.69 (1H, dd,= 11.2, 4.8 Hz, H-11b)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 125.2 (C-1), 115.0 (C-2), 145.6 (C-3), 149.1 (C-4), 115.7 (C-5), 122.0 (C-6), 147.4 (C-7), 112.0 (C-8), 163.8 (C-9), 141.4 (C-10), 97.9 (C-11)。以上数据经查阅文献报道[15]，鉴定化合物8为咖啡酸乙烯酯。

化合物9：白色粉末，ESI-MS/: 239 [M－H]−，分子式为C15H26O2。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 5.25 (1H, brd,= 4.8 Hz, H-8), 4.25 (1H, s, 1-OH), 3.78 (1H, s, 4-OH), 3.05 (1H, d,= 8.8 Hz, H-1), 2.11 (1H, m, H-11), 1.95～1.57 (8H, m, H-2, H-3, H-6, H-9), 1.03 (3H, s, CH3-15), 0.98 (6H, d,= 5.6 Hz, 12, 13-CH3), 0.83 (3H, s, CH3-14)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 78.1 (C-1), 26.9 (C-2), 39.8 (C-3), 69.0 (C-4), 46.1 (C-5), 22.9 (C-6), 141.8 (C-7), 115.9 (C-8), 40.5 (C-9), 37.3 (C-10), 34.5 (C-11), 21.1 (C-12), 21.8 (C-13), 11.7 (C-14), 29.6 (C-15)。以上数据经查阅文献报道[16]，鉴定化合物9为oplodiol。

化合物10：白色粉末，ESI-MS/: 257 [M－H]−，分子式为C15H28O3。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 5.62 (1H, d,= 2.4 Hz, 1-OH), 5.45 (1H, s, 4-OH), 4.33 (1H, d,= 3.6 Hz, 6-OH), 3.05 (1H, dt,= 4.0, 7.6 Hz, H-1), 1.96 (1H, m, H-11), 1.16 (3H, s, CH3-15), 1.03 (3H, d,= 5.2 Hz, 12-CH3), 0.86 (3H, d,= 5.2 Hz, 13-CH3), 0.80 (3H, s, 14-CH3)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 77.8 (C-1), 28.1 (C-2), 35.7 (C-3), 71.8 (C-4), 46.4 (C-5), 71.8 (C-6), 49.7 (C-7), 23.5 (C-8), 40.3 (C-9), 40.0 (C-10), 24.8 (C-11), 22.2 (C-12), 22.4 (C-13), 14.0 (C-14), 24.5 (C-15)。以上数据经查阅文献报道[17-18]，鉴定化合物10为lβ,4β,6βtrihydroxyeudesmane。

化合物11：无色油状物，ESI-MS/: 255 [M＋H]+，分子式为C15H28O3。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 4.85 (1H, d,= 5.2 Hz, 6-OH), 3.38 (1H, m, H-6), 3.02 (1H, dd,= 8.8, 6.0 Hz, H-1), 2.72 (1H, d,= 8 Hz, H-5), 2.14-1.54 (8H, m, H-2, 3, 8, 9), 1.54 (1H, m, H-11), 1.29 (3H, s, CH3-15), 1.23 (3H, s, CH3-14), 0.86 (6H, d,= 6.2 Hz, 12, 13-CH3)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 59.0 (C-1), 24.2 (C-2), 34.1 (C-3), 58.9 (C-4), 67.6 (C-5), 68.7 (C-6), 48.9 (C-7), 22.6 (C-8), 40.5 (C-9), 59.3 (C-10), 31.5 (C-11), 20.5 (C-12, C-13), 16.5 (C-14), 16.4 (C-15)。以上数据经查阅文献报道[19]，鉴定化合物11为1β,10α,4β,5α-diepoxy-7α-germacran-6β-ol。

化合物12：无色透明油状物，ESI-MS/: 239 [M－H]−，分子式为C15H26O2。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 4.65 (2H, d,= 13.2 Hz, H-14a, 14b), 4.41 (1H, s, 4-OH), 3.85 (1H, dd,= 6.8, 3.2 Hz, H-6), 3.78 (1H, d,= 3.2 Hz, 6-OH), 2.19 (1H, dd,= 8.8, 3.2 Hz, H-1), 2.01 (1H, m, H-7), 1.55 (8H, m, H-2, 3, 8, 9), 1.16 (3H, s, CH3-15), 0.92 (3H, d,= 5.2 Hz, CH3-12), 0.87 (3H, d,= 5.2 Hz, CH3-13)；13C-NMR (125 MHz, DMSO-6): 42.8 (C-1), 26.4 (C-2), 40.4 (C-3), 79.5 (C-4), 60.0 (C-5), 70.6 (C-6), 48.3 (C-7), 23.4 (C-8), 36.6 (C-9), 153.2 (C-10), 29.2 (C-11), 21.5 (C-12), 21.4 (C-13), 106.9 (C-14), 23.9 (C-15)，以上数据经查阅文献报道[20-21]。鉴定化合物12为teucladiol。

化合物13：白色粉末，ESI-MS/: 239 [M－H]−，分子式为C15H26O2。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 4.22 (1H, d,= 2.8 Hz, 9-OH), 3.93 (1H, s, 1-OH), 3.17 (1H, dd,= 14.8, 2.0 Hz, H-9), 2.09 (1H, m, H-2), 1.88 (2H, m, H-3), 1.78 (1H, m, H-5), 0.93 (6H, s, 13, 14-CH3), 0.76 (3H, s, CH3-15)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-d): 69.0 (C-1), 38.1 (C-2), 34.1 (C-3), 34.2 (C-4), 43.0 (C-5), 20.2 (C-6), 35.0 (C-7), 38.8 (C-8), 70.2 (C-9), 28.0 (C-10), 33.3 (C-11), 43.1 (C-12), 20.9 (C-13), 30.5 (C-14), 27.2 (C-15)，以上数据经查阅文献报道[22]，鉴定化合物13为caryolane-1, 9β-diol。

化合物14：白色粉末，ESI-MS/: 455 [M－H]−，分子式为C30H48O3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 5.28 (1H, brs, H-12), 3.21 (1H, dd,= 10.4, 4.0 Hz, H-3), 2.81 (1H, dd,= 13.6, 4.0 Hz, H-18), 1.13 (3H, s, H-23), 0.98 (3H, s, H-27), 0.92 (3H, s, H-24), 0.90 (3H, s, H-29), 0.89 (3H, s, H-30), 0.76 (3H, s, H-25), 0.74 (3H, s, H-26)；13C-NMR (125 Hz, CDCl3): 38.7 (C-1), 28.0 (C-2), 79.0 (C-3), 38.3 (C-4), 55.1 (C-5), 18.2 (C-6), 33.7 (C-7), 39.2 (C-8), 47.6 (C-9), 37.0 (C-10), 27.9 (C-11), 122.6 (C-12), 143.5 (C-13), 41.5 (C-14), 27.6 (C-15), 23.3 (C-16), 45.8 (C-17), 40.9 (C-18), 46.4 (C-19), 30.6 (C-20), 33.7 (C-21), 32.5 (C-22), 27.1 (C-23), 15.5 (C-24), 15.3 (C-25), 17.1 (C-26), 25.9 (C-27), 182.7 (C-28), 32.4 (C-29), 23.5 (C-30)。以上数据经查阅文献报道[23]，鉴定化合物14为齐墩果酸。

化合物15：白色粉末，ESI-MS/: 455 [M－H]−，分子式为C30H48O3。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d): 5.12 (1H, t,= 6.8 Hz, H-12), 4.28 (1H, d,= 5.2 Hz, 3-OH), 2.99 (1H, m, H-3), 1.03 (3H, s, H-23), 0.89 (3H, s, H-25), 0.89 (3H, d,= 7.4 Hz, H-30), 0.86 (3H, s, H-26), 0.80 (3H, d,= 7.6 Hz, H-29), 0.74 (3H, s, H-24), 0.67 (3H, s, H-27)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 38.2 (C-1), 27.5 (C-2), 76.8 (C-3), 38.3 (C-4), 54.7 (C-5), 17.9 (C-6), 32.6 (C-7), 41.6 (C-8), 47.0 (C-9), 35.5 (C-10), 22.8 (C-11), 124.5 (C-12), 138.1 (C-13), 40.0 (C-14), 26.9 (C-15), 23.8 (C-16), 46.8 (C-17), 52.3 (C-18), 38.4 (C-19), 38.4 (C-20), 30.1 (C-21), 35.3 (C-22), 28.2 (C-23), 15.2 (C-24), 16.0 (C-25), 16.9 (C-26), 23.2 (C-27), 178.2 (C-28), 17.0 (C-29), 21.0 (C-30)。以上数据经查阅文献报道[24]，鉴定化合物15为乌苏酸。

化合物16：白色粉末，ESI-MS/: 473 [M－H]−，分子式为C30H48O4。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d): 5.16 (1H, t,= 5.6 Hz, H-12), 4.29 (1H, d,= 4.4 Hz, 3-OH), 3.75 (1H, s, 19-OH), 3.00 (1H, m, H-3), 1.28 (3H, s, H-27), 1.03 (3H, s, H-26), 0.90 (3H, s, H-23), 0.89 (3H, s, H-24), 0.85 (3H, d,= 2.4 Hz, H-30), 0.80 (3H, s, H-29), 0.74 (3H, s, H-25)；13C-NMR (125 Hz, DMSO-6): 38.1 (C-1), 27.0 (C-2), 76.9 (C-3), 38.4 (C-4), 54.8 (C-5), 18.1 (C-6), 32.7 (C-7), 40.1 (C-8), 46.7 (C-9), 36.5 (C-10), 23.1 (C-11), 126.8 (C-12), 138.6 (C-13), 41.1 (C-14), 28.1 (C-15), 25.2 (C-16), 46.9 (C-17), 53.2 (C-18), 71.6 (C-19), 41.4 (C-20), 25.9 (C-21), 37.2 (C-22), 28.2 (C-23), 16.0 (C-24), 16.3 (C-25), 16.0 (C-26), 23.9 (C-27), 178.9 (C-28), 26.4 (C-29), 15.1 (C-30)。以上数据经查阅文献报道[25]，鉴定化合物16为3β,19α-二羟基-12-烯-28-乌苏酸。

化合物17：无色油状物，ESI-MS/: 427 [M－H]−，分子式为C28H44O3。1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 6.50 (1H, d,= 6.8 Hz, H-7), 6.24 (1H, d,= 6.8 Hz, H-6), 5.22 (1H, dd,= 12.0, 6.0 Hz, H-22), 5.18 (1H, dd,= 12.0, 6.4 Hz, H-23), 3.97 (1H, m, H-3), 0.99 (3H, d,= 5.6 Hz, H-27), 0.90 (3H, d,= 5.6 Hz, H-28), 0.87 (3H, s, H-19), 0.83 (3H, d,= 4.2 Hz, H-26), 0.82 (3H, d,= 4.2 Hz, H-21), 0.81 (3H, s, H-18)；13C-NMR (125 Hz, CDCl3): 34.6 (C-1), 31.9 (C-2), 66.5 (C-3), 36.8 (C-4), 82.1 (C-5), 135.4 (C-6), 130.7 (C-7), 79.4 (C-8), 51.0 (C-9), 36.9 (C-10), 20.6 (C-11), 39.3 (C-12), 44.5 (C-13), 51.0 (C-14), 23.4 (C-15), 28.6 (C-16), 56.1 (C-17), 12.8 (C-18), 18.1 (C-19), 39.7 (C-20), 20.8 (C-21), 135.2 (C-22), 132.3 (C-23), 42.7 (C-24), 33.0 (C-25), 19.6 (C-26), 19.9 (C-27), 17.5 (C-28)。以上数据经查阅文献报道[26]，鉴定化合物17为5α,8α-环二氧-24()-甲基麦角甾- 6,22-二烯-3β-醇。

化合物18、19与β-谷甾醇、豆甾醇对照品共薄层，不同体系展开剂展开Rf值相同，与对照品混合熔点不下降，故确定化合物18为β-谷甾醇，化合物为19豆甾醇。

4 抗炎活性的评价

通过检测化合物1～19对LPS诱导的RAW 264.7小鼠巨噬细胞中NO的释放量，然后优选出具有较好抑制活性的化合物，重复实验，测定LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞中炎症因子（TNF-、IL-6和IL-1β）的分泌量来评价其抗炎活性，结果见图1。图中LPS为LPS诱导组，Dex为阳性对照组，1～19为实验组。结果表明，与对照组相比，LPS诱导的RAW 264.7小鼠巨噬细胞中NO的释放以及炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的分泌显著升高。与LPS组相比，大多数化合物在20 μg/mL的质量浓度下都能较好地抑制NO的释放以及炎症因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的分泌，化合物4、7、9、12～14、17～19均能较好地抑制NO的释放，其中化合物19抑制NO释放的能力相当于阳性对照组。根据抑制NO的抑制效果，选取化合物4、7、9、12～14、17～19进行炎症因子的测定，结果表明化合物4、9能够较好地抑制TNF-α分泌，其中化合物9的抑制效果与阳性对照组相当；化合物4、9、12～14、17、19在抑制IL-6的分泌上表现出更好的作用，其中13、19的抑制效果优于阳性对照组；化合物4、9、12、13、17、19在抑制IL-1β的分泌上展现出更好的抑制率，其中4的抑制效果优于阳性对照组（图1）。

5 讨论

本实验对东紫苏全株的醋酸乙酯层进行研究，从中分离并鉴定单体化合物19个，化合物1～7为黄酮类化合物，9～13为倍半萜类化合物，14～16为三萜类化合物，17～19为甾体类化合物，8为苯丙素类化合物，其中7、9～13、17首次从该属中分离得到。体外抗炎活性结果表明大多数化合物在20 μg/mL下均能有效抑制NO的释放，化合物4、9能够较好地抑制TNF-α分泌，化合物4、12～14、19在抑制IL-6的分泌上展现出更好的抑制活性，化合物4、9、12、13、17、19在抑制IL-1β的分泌上展现出更好的抑制作用。本实验丰富了东紫苏中化合物种类和药理活性的研究，进一步阐述了东紫苏的药用价值，为后续东紫苏的活性筛选提供理论支撑和研究方向。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Chemical constituents fromand their anti-inflammatory activities

YANG Gang1, CUI Xiao-yan2, ZHANG Jia-xiong3, CHEN Tai-ming3, LIU Ya-ping3, WANG Yi-fen1, 4

1. School of Traditional Chinese Medicine, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China 2. Kunming Medical University Haiyuan Collage, Kunming 650106, China 3. Faculty of Food Science and Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China 4. Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China

The purpose was to analyze the chemical compositions and their anti-inflammatory activities from.The separation and purification of compounds were performed by normal-phase silica gel chromatography column (CC), Sephadex LH-20 CC, ODS CC, and high-performance liquid chromatography (HPLC). The structures of the isolated compounds were identified based on the nuclear magnetic resonance spectroscopies (NMR) data and comparison with corresponding data of the reported literature. All the isolated compounds were assessed for their anti-inflammatory effects via detecting inflammatory mediator releases (IL-6, IL-1β, TNF-α) and NO medium level in RAW 264.7 macrophage cells induced by LPS.A total of 19 compounds were isolated from the ethyl acetate layer of, including 7 flavonoids, 5 sesquiterpenoids, 3 triterpenoids, 3 steroids and 1 phenylpropanoids compound. The structures of these isolates were unambiguously identified as apigenin (1), luteolin (2), chrysin (3), luteolin-7βglucoside (4), eriodictyol (5), pinocembrin (6), semecarpanone (7), caffeic acid ethylene ester (8), oplodiol (9), lβ,4β,6βtrihydroxyeudesmane (10), 1β,10α,4β,5α-diepoxy-7α-germacran-6β-ol (11), teucladiol (12), caryolane-1,9β-diol (13), oleanelic acid (14), ursolic acid (15), pomolic acid (16), 5α,8α-epidioxy-24()- methylergosta-6, 9(11), 22-trien-3β-ol (17), β-sitoster (18), stigmasterol (19).Compounds 7, 9—13 and 17 are isolated from this genusfor the first time. Compounds 1, 4, 9, 12—14 and 17—19 significantly reduce the release of NO and inhibited the secretion of inflammatory mediators (IL-6、IL-1β、TNF-α) in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages cells at the concentration of 20μg·mL−1, comparable to DXM used as the positive control, which suggested thatmight be possess the anti-inflammatory activity.

Vaniot; isolated and identified; LPS induction; anti-inflammatory activity; inflammatory factors; semecarpanone; oplodiol; 5α, 8α-epidioxy-24()-methylergosta-6, 9(11), 22-trien-3β-ol

R284.1

A

0253 - 2670(2023)12 - 3777 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.12.004

2023-03-08

云南省基础研究面上项目（202101AT070436，202101BE070001-053）

杨刚（1998—），男，在读硕士，专业方向为中药药效物质基础研究。E-mail: 2661436316@qq.com

通信作者：王易芬，博士，副研究员，研究方向为植物化学与物质资源。E-mail: wangyifen@mail.kiz.ac.cn

刘亚平，博士，副教授，研究方向为植物化学与物质资源。E-mail: liuyaping@kust.edu.cn

#并列第一作者：崔小燕（1986—），女，副教授，研究方向为有机化学。E-mail: cuixiaoyan910@163.com

[责任编辑 王文倩]