卵巢颗粒细胞能量代谢与低氧调控机制的研究进展

王敬,王玲朝

卵泡发育是受多种基因、激素、细胞因子等相互协调,共同调控的动态过程,历经原始卵泡的启动募集、窦前卵泡的发育、优势卵泡的选择、排卵和黄体生成4个阶段[1]。这个生物学过程复杂且漫长,以卵泡直径增大伴随颗粒细胞增殖和功能分化为特征。卵母细胞周围的颗粒细胞在卵泡发育过程中不仅影响卵母细胞胞质成熟,而且通过自身特有的卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH)和黄体生成素(luteinizing hormone,LH)受体,完成对促性腺激素的应答反应,参与促性腺激素对卵母细胞核的促成熟作用[2-3]。因此颗粒细胞对卵母细胞发育至关重要。Alvarez GM等[4]和Zhang Y等[5]报道,颗粒细胞功能受损和能量代谢的异常是造成女性卵泡发育异常和生育力下降的重要原因之一。因此,本文将着重从颗粒细胞能量代谢及调控机制对卵泡发育的影响方面进行综述。

1 卵母细胞能量需求及对颗粒细胞的调控机制

卵母细胞的发育、成熟、受精以及胚胎发育过程依赖于卵母细胞内线粒体功能的正常发挥[6]。在卵母细胞能量代谢过程中,大部分葡萄糖首先经过颗粒细胞糖酵解为丙酮酸,然后通过单羧酸转运系统转运至卵母细胞的线粒体中[7],为卵母细胞能量生产提供能量底物[8]。卵母细胞亦通过分泌卵母细胞分泌因子(oocyte-secreted factors,OSFs)包括生长分化因子-9(growth differentiation factor-9,GDF-9)和骨形态发生蛋白-15(bone morphogenetic protein-15,BMP-15)等成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)-β超家族成员,调控颗粒细胞的增殖、分化和代谢活动[9-12]。另外卵母细胞亦分泌FGF7和FGF10等促进颗粒细胞增殖,介导卵泡的募集和发育[13]。卵母细胞对颗粒细胞增殖与能量代谢的调控是一个复杂多变的过程[14],受卵泡发育的不同阶段、激素水平、颗粒细胞能量状态等多种因素影响。

2 颗粒细胞能量代谢与调控

卵巢颗粒细胞是卵泡的重要组成细胞,在女性生殖过程中发挥重要作用[15]。颗粒细胞通过缝隙连接和旁分泌因子为卵母细胞的发育和成熟提供营养支持[16]。Uyar A等[17]报道颗粒细胞受损会影响激素和细胞因子的分泌,降低卵母细胞的质量及胚胎发育潜能。

2.1 糖酵解功能与颗粒细胞能量代谢

卵泡液将颗粒细胞分隔成两个细胞亚群,包括衬在卵泡壁上的壁层颗粒细胞(mural granulosa cells,mGCs)和围绕在卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞(cumulus granulosa cells,cGCs)。cGCs包绕在卵母细胞周围,cGCs的胞膜突起穿过透明带与卵子的胞膜形成缝隙连接,从而与卵母细胞形成紧密结合的合胞体,通过复杂的细胞间连接机制影响着卵泡的发育。有研究发现猪早期窦卵泡中约有8 000个颗粒细胞。这个数目随着卵泡发育增大逐渐增加,发展至窦状卵泡时含有多达1.0×106个颗粒细胞(直径3～6 mm)[18]。颗粒细胞提供维持卵母细胞基础代谢活性所需85%的营养物质,并发出调节其分化的信号。基于上述理论,为了获得高质量的卵母细胞,颗粒细胞能量代谢稳定及代谢方式的适应性转变在卵泡生长发育过程中扮演着重要角色。

在卵母细胞成熟的过程中,因卵母细胞内糖酵解酶表达低,大部分葡萄糖首先经过颗粒细胞糖酵解为丙酮酸,后者通过单羧酸转运系统转运至卵母细胞的线粒体中,成为卵母细胞能量产生的底物[7-8,19]。多项研究表明,颗粒细胞的代谢功能直接影响卵母细胞的质量和发育潜能,进而影响卵泡的发育。Jahromi BN等[3]研究卵母细胞体外成熟过程中发现,未经颗粒细胞培养的人未成熟卵母细胞碎片率增加,胚胎发育延迟,影响胚胎质量和发育潜能。另外,有多项涉及人类及动物卵母细胞发育的研究均证实此观点,即与未经颗粒细胞培养的卵母细胞相比,加入颗粒细胞培养的未成熟卵母细胞在成熟率和胚胎发育能力方面显著提高。颗粒细胞含有多种糖酵解相关酶,在糖酵解代谢过程中可以产生丙酮酸并转运给卵母细胞,为卵母细胞提供能量底物,进而为胞浆及胞核的成熟提供能量支持。Munakata Y等[19]观察牛卵母细胞体外培养过程发现,卵母细胞的能量状态包括脂质和ATP含量以及H4K12乙酰化水平与颗粒细胞数量及葡萄糖的消耗量密切相关。Bao Y等[7]研究发现,将猪卵冠丘复合物及裸卵体外培养,在猪卵冠丘复合物培养体系中加入5.6 mM葡萄糖或2 mM丙酮酸,囊胚形成率得到明显改善,而裸卵体外培养过程中加入葡萄糖不会影响卵母细胞成熟及胚胎形成率,但加入丙酮酸后却能明显改善卵母细胞发育潜能。说明颗粒细胞糖代谢对于卵母细胞发育成熟有协同促进作用,并且颗粒细胞通过自身糖酵解功能为卵母细胞发育提供能量底物。张玲等[20]对卵巢组织中各级卵泡间磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFK)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)蛋白的表达进行比较发现,原始卵泡和初级卵泡中颗粒细胞上PFK和LDH表达量均高于卵母细胞,而且窦卵泡中颗粒细胞PFK和LDH的表达量高于原始卵泡和初级卵泡,进一步说明从卵泡发育初期,颗粒细胞就表现出较强的糖酵解活性,通过高糖酵解活性,维持卵母细胞能量代谢稳定。

2.2 颗粒细胞线粒体功能与能量代谢

线粒体是真核细胞的重要细胞器之一,是细胞内主要ATP的生成中心。线粒体被称为细胞的能量加工工厂,以三羧酸循环和氧化磷酸化反应产生ATP维持细胞生命活动。葡萄糖、脂肪酸、氨基酸等转化为(乙酰辅酶A)乙酰CoA,最终都会进入线粒体的氧化呼吸链,合成ATP为细胞提供能量,并且通过调节代谢、钙离子动态平衡、调节膜电位控制细胞程序性死亡,参与细胞生长、分化、增殖、凋亡、信号传导等细胞活动[21]。哺乳动物细胞中线粒体通过产生能量的关键反应氧化磷酸化、代谢方式和代谢底物的转换、以及细胞凋亡等生物学事件,对细胞内、外环境压力改变做出适应性调整。线粒体膜电位是细胞活力的重要指标。因此,破坏线粒体功能,对细胞增殖和存活有负面影响。

颗粒细胞线粒体功能的稳定对维持颗粒细胞糖酵解功能以及维持卵母细胞胞质内稳态至关重要[22]。有文献报道,接受控制性促排卵的女性颗粒细胞线粒体DNA(mtDNA)含量降低将伴随卵巢储备减少,颗粒细胞呈低ATP水平的子宫内膜异位症患者体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)妊娠率下降[23-24]。在卵巢发育周期过程中,颗粒细胞线粒体的功能正常对卵母细胞的成熟、质量提高及女性生育能力的维持至关重要[25-26]。另有研究发现,在控制性超排卵过程中,卵丘线粒体膜电位与获卵数和MII数呈正相关,cCGs中mtDNA拷贝数可作为胚胎着床潜能的生物标志物[26]。改善颗粒细胞线粒体功能可以有效提高卵母细胞活性及IVF-ET成功率[27]。所以,颗粒细胞能量代谢稳定对卵母细胞的质量、胚胎的发育潜能、妊娠率等都有重要影响[28]。

3 低氧促进颗粒细胞能量代谢模式转换

低氧是机体在能量代谢、血管生成、细胞增殖和细胞死亡等过程中遇到的一种生理应激。缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)被认为是在细胞氧稳态调节过程中起核心作用的转录因子,机体在缺氧的情况下激活转录因子,调节低氧相关基因的转录,并参与低氧反应信号的传递过程[29]。HIF-1由120 kD的HIF-1α亚单位和91-94 kD的HIF-1β亚单位组成。HIF-1α主要表达于细胞核中,在常氧条件下可迅速降解,HIF-1β亚基稳定表达于细胞核和细胞质中,不受外界环境影响[30]。在低氧条件下,羟基化作用被抑制,HIF-1α不断积累,与稳定表达的HIF-1β亚基形成异源二聚体HIF-1,并与其靶基因如糖酵解基因和血管形成基因上的缺氧反应元件结合,通过调节基因的表达来实现其功能[31-32],参与细胞代谢、自分泌、氧稳态、能量维持及增生等活动,从而调解机体炎症、发育、肿瘤发生、缺氧适应等生理和病理过程。目前已知HIF-1可以和超过70种基因的缺氧反应元件结合,调节基因产生相应的蛋白,调控基因的转录激活。研究较多的HIF-1的靶基因主要包括以下种类:① 血管生成相关基因,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和纤溶酶原激活物抑制剂1;② 控制细胞生长和代谢的基因,如葡萄糖转运子 1(glucose transporter-1,GLUT-1)、GLUT-3和糖酵解酶,乳酸脱氢酶 A(1actate dehedrogenase A,LDHA),磷酸果糖激酶(phosphofructokinase,PFKP)等;③ 调节增殖的基因,如胰岛素样生长因子-2(insulin like growth factor-2,IGF-2)和p21等等,还有新的被调控的基因不断被发现。另外,迄今为止,多种作用机制被描述为低氧条件下糖酵解的重要调节机制,包括HIF途径[33]、PI3K/Akt途径[34]和缺氧依赖性糖酵解酶的翻译后修饰途径[35]。通过对HIF通路的药理学研究发现,在细胞水平上激活HIF途径促进了糖酵解活性,且对细胞具有保护作用[36],进一步证明HIF在调节葡萄糖代谢中发挥显著作用。因此,HIF对细胞能量代谢的稳定作用是值得进一步研究的领域。

缺氧条件下HIF-1α在哺乳动物和人体细胞内广泛表达和聚集,参与细胞内多种病理生理过程,包括细胞生长发育、细胞分化和细胞缺氧耐受、细胞内氧稳态、细胞凋亡与肿瘤发生。卵泡的发育、生长、排卵及随后的黄体早期发育均将处于局部低氧或缺氧的条件下[37]。动物实验证实,HIF-1α在哺乳动物卵泡发育过程中会通过VEGF促进血管的生成,间接提示卵泡发育过程中存在低氧过程,而且促性腺激素诱导的细胞过度增殖促进了HIF-1α的积累,HIF-1α又对颗粒细胞增殖具有保护作用[38]。Thompson JG等[39]报道,卵泡发育前的窦状卵泡期氧浓度处于正常水平,当优势卵泡发育成熟时,周围膜细胞层中血管的密度减少,氧浓度降低,激活促性腺激素、低氧诱导因子及血红蛋白等信号因子。因此,在卵泡发育成熟期维持短暂的低氧环境。而且卵泡发育成熟后脱离卵泡壁导致脉管系统脱落,以及黄体形成时脉管系统的重塑都会降低氧浓度。

为了适应低氧环境,细胞内代谢方式亦发生变化,从氧化代谢向糖酵解代谢模式转换。糖酵解本质上比氧化磷酸化反应产生ATP效率低,因此,为了补偿降低的效率,HIF-1α激活葡萄糖转运蛋白GLUT1和GLUT3的表达,以增加糖酵解底物的传递,另一方面降低了线粒体对葡萄糖的氧化速率[40]。Shiratsuki S等[41]对诱导低氧环境体外培养牛颗粒细胞观察发现,低氧环境促进HIF-1α基因的表达和HIF-1α蛋白累积增加,促进颗粒细胞代谢模式从线粒体氧化磷酸化向糖酵解代谢模式转换,这与低氧激活糖酵解活性、抑制线粒体氧化磷酸化有关。并且其研究发现,低氧条件糖酵解活性增加有助于卵泡成熟过程中颗粒细胞增殖。这一过程对于高质量的卵母细胞和胚胎发育也是必不可少的。另外,Kitagawa Y等[42]研究指出,低氧浓度通过降低过氧化氢的含量,减少DNA碎片来提高胚胎的活力,促进胚胎发育。

卵泡的正常发育是一个复杂的过程,良好的卵巢内环境需要全身内分泌系统和卵巢旁分泌系统共同参与维持。动物实验证实,促性腺激素诱导的细胞过度增殖促进了HIF-1α的积累,HIF-1α又对颗粒细胞增殖具有保护作用[38]。然而,目前关于HIF-1α的表达对人颗粒细胞能量代谢方式的影响鲜有报道。研究人颗粒细胞代谢功能与HIF-1α的相关性,为更深入研究人卵巢局部调控机制对卵子质量的影响不失为一个更直接、有效的方向。

4 展望

卵子质量的降低与不孕患者辅助生殖不良结局之间有密切联系。随着对卵巢局部调控机制的研究发现,颗粒细胞的功能紊乱,是导致卵子质量下降的关键因素。颗粒细胞代谢稳定对维持卵巢内环境稳定,促进卵母细胞的后期发育及最后成熟起着至关重要的作用,对于改善不孕患者妊娠结局有重要意义。