育龄女性亚甲基四氢叶酸还原酶基因多态性研究＊

滕俊萍 索 峰 张 燕 王 亿 缑灵山 顾茂胜

徐州市妇幼保健院 (江苏 徐州 221009)

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是叶酸-甲硫氨酸代谢途径中的关键酶，可以将5,10-亚甲基四氢叶酸催化为5-甲基四氢叶酸参与多种人体内生化反应。在人类及其它真核生物中，亚甲基四氢叶酸还原酶是由两个黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FDA)分子以非共价结合形成的二聚体[1]。因此，MTHFR基因上的位点突变会导致FDA分子发生解离，引起酶结构和活性改变，造成同型半胱氨酸水平增加及DNA 甲基化水平降低[2]。

MTHFR基因 C677T 位点多态性与癌症、心血管疾病、妊娠不良结局、胎儿发育异常及男性不育等多种临床疾病有关，也有研究报道证实孕妇机体叶酸水平不足与胎儿出生缺陷的发生有密切关系[3]。但叶酸过量服用也可能引起消化道反应、影响锌元素吸收，诱发惊厥，增加后代自闭症、过敏性疾病等疾病的患病风险[4-5]。其中叶酸缺乏是由于机体利用能力差和叶酸补充不足等因素引起，而MTHFR基因多态性会造成叶酸的利用能力受到影响。因此，检测叶酸代谢相关代谢基因的多态性，依据叶酸缺乏风险大小合理补充叶酸，有助于降低孕期女性疾病风险，减少新生儿出生缺陷发生。本研究通过对徐州地区育龄女性MTHFR基因C677T位点多态性进行分析，对育龄女性叶酸代谢能力进行精准评估，以期为孕期女性精准补充叶酸提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象2015年6月至2021年6月于徐州市妇幼保健院行孕前及孕期检查的育龄女性4983例，均为徐州市常住人口。所有研究对象均未重复纳入，纳入标准：孕前及孕期检查的育龄女性，排除易造成叶酸代谢异常的家族性遗传性疾病、血液系统或免疫系统疾病及急慢性疾病等，检测均经过知情同意。

1.2 方法使用紫头管(乙二胺四乙酸，EDTA)采集2mL静脉血，Lab-Aid 824 全血基因组DNA核酸提取试剂(Zeesan,Xiamen)获取基因组DNA，NanoDrop 2000检测DNA纯度与浓度。采用实时荧光定量PCR法及MTHFR C677T基因检测试剂盒(江西诺德医疗器械有限公司)行位点多态性检测。所有实验操作严格按照操作说明书进行。

1.3 统计方法使用SPSS 21.0对数据进行统计分析。采用百分比(%)表示计数资料，采用χ2检验组间差异是否具有显著性，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 Hardy-Weinberg平衡分析针对入组样本群体亚甲基四氢叶酸还原酶C677T位点的基因型(CC，CT，TT)进行哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinberg)检验，结果显示实际频数和理论频数无显著差异(χ2=1.071,P=0.585 ＞0.05)符合哈-温平衡，入组群体具备代表性，见表1。

表1 Hardy-Weinberg遗传平衡分析

2.2 MTEERC677T 基因多态性分布统计结果显示徐州地区育龄女性MTHFR基因C677T位点野生型(CC)、杂合突变类型(CT)及纯合突变类型(TT)频率分别为20.61%(1027/4983)、48.44%(2414/4983)和30.95%(1542/4983)，其中杂合突变CT型为主，人体对叶酸的利用能力处于中等水平，对叶酸的代谢基本正常，但是为了降低胎儿发生神经椎管畸形的风险，建议孕妇根据医生建议适量补充叶酸。纯合突变型TT占比超过30%，这部分育龄期妇女存在叶酸代谢障碍，需要根据医生建议加大叶酸的补给，避免对个体和新生儿产生影响。数据见表2。

表2 徐州地区育龄女性与其它地区MTFR C677T基因型与基因频率比较

表2 徐州地区育龄女性与其它地区MTFR C677T基因型与基因频率比较

组别 例数 基因型频率 χ2P 基因频率 χ2 P CC CT TT C T例数/频率 例数/频率 例数/频率 数量/频率 数量/频率本研究 4983 1027/20.6% 2414/48.4% 1542/31.0% 4468/44.29% 2749/55.71%张家口 860 158/18.4% 429/49.9% 273/31.7% 2.274 0.321 745/43.31% 975/56.69% 197.602 0.000新乡 1352 201/14.9% 625/46.2% 526/38.9% 39.828 0.000 1027/37.98% 1677/62.02% 455.800 0.000郑州 249 46/18.5% 123/49.4% 80/32.1% 0.679 0.712 215/43.17% 283/56.83% 68.557 0.000西安 3492 800/22.9% 1710/49.0% 982/28.1% 10.649 0.005 3310/47.39% 3674/52.61% 301.876 0.000德阳 2573 1047/(40.7%) 1171(45.5%) 355(13.8%) 451.123 0.000 3265/63.45% 1881/36.55% 3.033 0.082三河市 701 95/15.8% 281/46.8% 325/37.4% 69.036 0.000 471/33.59% 931/66.41% 384.674 0.000淄博 1041 130/12.5% 457/43.9% 454/43.6% 75.005 0.000 717/34.44% 1365/65.56% 494.334 0.000临沂 825 138/16.7% 398/48.2% 289/35.1% 9.073 0.011 674/40.8% 976/59.2% 244.519 0.0012武汉 2899 1069/36.9% 1367/47.1% 463/16.0% 344.511 0.000 3505/60.45% 2293/39.55% 1281.231 0.000苏州 1887 565/29.9% 913/48.4% 409/21.7% 92.854 0.000 2043/54.13% 1731/45.87% 62.053 0.000镇江 2885 877/30.4% 1378/47.8% 630/21.8% 127.428 0.000 3132/54.28% 2638/45.72% 76.873 0.000昆明 297 116/39.1% 139/46.8% 42/14.1% 70.600 0.000 371/62.46% 223/37.54% 0.070 0.791广东 1124 578/51.4% 463/41.2% 83/7.4% 532.902 0.000 1619/72.02% 629/27.98% 76.336 0.000琼海 1221 756/61.9% 390/31.9% 75/6.2% 872.794 0.000 1902/77.89% 540/22.11% 207.422 0.000

2.3 徐州地区育龄女性MTHFRC677T基因多态性分布与文献报道的比较将本研究获得的徐州地区育龄女性的MTHFR基因C677T位点多态性结果与已有文献报道的其它地区进行比较。结果显示与新乡、西安、德阳、三河市、淄博、武汉、苏州、镇江、昆明、广东、琼海等地结果相比，徐州地区育龄女性MTHFR C677T基因型频率有显著差异(P＜0.05)。然而，徐州地区与张家口、郑州、临沂等地育龄女性相比，无明显差异(P＞0.05)。另外，此次纳入的育龄女性群体与张家口、新乡、西安、郑州、淄博、三河市、临沂、武汉、苏州、镇江、广东、琼海等区域育龄女性MTHFR C677T位点的等位基因频率比较，具有统计学意义(P＜0.05)，与德阳、昆明等地相比无显著差异(P＞0.05)，见表2。

3 讨 论

新生儿出生缺陷的发生与孕妇机体内叶酸水平不足有密切联系。有研究报道证实围孕期补充叶酸可以降低新生儿神经管缺陷发生率，降低妊娠高血压、流产、早产、死产等风险[6]。亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T位点多态性可影响编码的酶活性和酶水平，影响血浆中叶酸及甲硫氨酸水平[7]。因此，检测叶酸代谢相关基因位点多态性可以指导孕妇合理补充叶酸。本实验分析了徐州地区4983例育龄女性样本，发现徐州地区育龄女性MTHFR C677T位点CC型、CT型及TT型频率分别为20.6%(1027/4983)、48.4%(2414/4983)和31.0%(1542/4983)，突变基因T的频率为55.71%。通过了解徐州地区育龄女性MTHFR基因C677T位点多态性趋势，本文对于因地制宜制定合理的叶酸补充方案具有重要参考价值。

研究资料显示，我国神经管畸形发生率的大体趋势是北高南低的趋势，这与MTHFR纯合突变TT基因型的趋势相一致[7]。本研究TT基因型频率为31.0%，与国内其他地区进行比较TT基因型频率处于较高水平。徐州地区位于中国东部南北中部区域，是江苏的最北部，北面毗邻山东。徐州地区育龄女性TT基因型频率低于淄博、临沂、新乡等北方地区，低于南方地区，符合上述规律[8-14]。2017版《围受孕期增补叶酸预防神经管缺陷指南》推荐无高危因素的围受孕期女性每日增补叶酸0.4mg或0.8mg，对于CT或TT型的孕妇，需要增加叶酸补充剂量或延长孕前增补时间[4]。

人体内叶酸水平受膳食结构影响较大。有研究报道显示中国育龄妇女膳食叶酸摄入量南方比北方地区育龄妇女高，北方地区的农村较城镇低[15-16]。值得注意的是，我国神经管畸形的患病率也具有北方较南方高的特点，且北方地区农村的发病率高于城镇[17]。此外，血液叶酸水平与膳食叶酸摄入量情况具有相似性。这提示，围孕期叶酸的补充剂量除参考叶酸代谢基因多态性之外，需考虑膳食叶酸摄入量。对于在北方地区生活的育龄妇女，可以考虑适当增加富含叶酸食物的摄入量。

徐州地区人群叶酸代谢基因多态性具有明显的地域特征，本研究通过对叶酸代谢关键酶MTHFR基因C677T位点多态性展开研究，为本地区育龄女性叶酸补充剂量的合理选择提供科学依据。

研究结果显示，参与研究的孕龄妇女群体中TT型占31.0%，CT型占48.4%，其中育龄女性出现叶酸代谢障碍的占比较高。对于叶酸代谢障碍的围孕期女性，常规剂量的叶酸补充(400μg/d)无法满足妊娠需求，需要结合孕妇个体实际情况适当补充额外剂量叶酸。此外，在建议孕妇合理增补叶酸的同时，需要提示育龄妇女多食用富含叶酸的食物，养成健康生活方式。