苦碟子总黄酮影响心肌梗死大鼠心功能的作用机制

高丽华,孙玉艳,杨 然

1.沧州市人民医院心血管内科,沧州 061000;2.开滦总医院心内科,唐山 063000;3.开滦总医院药剂科,唐山 063000

心肌梗死(myocardial infarction, MI)由冠状动脉供血与心肌需求失衡导致,急性期死亡风险高,慢性期以心室重构和心力衰竭为特征[1]。研究表明,氧化应激是导致MI病理损伤的机制之一[2],磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)作为细胞内能量传感器蛋白激酶级联反应的下游靶标,可激活抗氧化防御系统[3],叉头框蛋白O1(fork head box protein O1,FOXO1)是一种重要的代谢转录因子,参与细胞的保护,使其免受过量活性氧(reactive oxygen species, ROS)的损伤,在氧化应激期间上调抗氧化水平[4]。苦碟子总黄酮(total flavonoids ofSowthistleleafixerisseedling,TFS)为抱茎苦荬菜的有效成分,对心肌缺血性损伤具有抑制作用[5]。本研究拟通过构建MI大鼠模型,并以脂溶性抗氧化剂辅酶Q10[6]作为阳性对照,探讨TFS对MI大鼠心功能的保护作用及可能的机制,以期为MI的药物治疗提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

iMagic-M7型全自动生化分析仪(深圳市美思康电子有限公司);Vevo®3100型超高分辨率小动物超声影像系统(加拿大Visual Sonics公司);Multiscan GO多功能酶标仪(美国赛默飞世尔公司);化学发光FluorChem®HD2凝胶成像系统(美国Alpha公司)。

1.2 试药

TFS(质量分数≥90%,吉林省通化华夏药业股份有限公司);辅酶Q10胶囊(规格为10 mg,上海上药信谊药厂有限公司);白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6,南京建成生物科技研究所);谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(malon-dialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)试剂盒均购自南京森贝伽生物科技有限公司;兔抗AMPK、兔抗FOXO1和兔抗磷酸化FOXO1(p-FOXO1)抗体均购自美国Abcam公司;兔抗磷酸化AMPK(p-AMPK)抗体(上海碧云天生物科技有限公司)。

1.3 动物

SPF级6周龄雄性Wistar大鼠85只,体质量(200±20) g,由长沙市天勤生物技术有限公司提供,许可证号SCXK(湘)2019-0013。

2 方法

2.1 分组及给药

将大鼠置于恒温(22±2) ℃、恒湿(55%±5%)条件下普通饲养,12 h光-暗循环适应1周后,随机选择15只大鼠作为假手术组,剩余70只用于构建MI大鼠模型:腹腔注射质量浓度为10 g·L-1的戊巴比妥钠(30 mg·kg-1)诱导麻醉并机械通气,用加热垫维持大鼠的正常体温,于第3、4肋骨间打开左侧胸腔,在肺动脉出口及左心房之间用6-0单尼龙线结扎左冠状动脉,心肌组织由红变白、脉搏减弱且心电图ST段抬高表明冠状动脉闭塞[7]。假手术组穿线后不结扎,其他操作与造模步骤一致。成功造模62只大鼠,随机剔除2只,将剩余大鼠随机分为模型组、TFS低剂量组、TFS高剂量组和辅酶Q10组,每组15只,术后48 h后给药。TFS低、高剂量组和辅酶Q10组[8]灌服给药剂量分别为5、10、30 mg·kg-1·d-1,假手术组与模型组大鼠均灌服等量生理盐水,连续给药28 d。

2.2 大鼠心脏血流动力学参数检测

末次给药结束后,腹腔注射30 mg·kg-1戊巴比妥钠麻醉,大鼠仰卧,钝性分离颈前肌以暴露右颈动脉,将压力传感器连接到BL-420F型生物功能实验系统,将浸有肝素的硬膜外导管经动脉壁切口插入并缓慢推向心脏,当舒张压突然下降到0 mmHg左右时,表明导管进入左心室;固定导管并记录左心室收缩压(left ventricular systolic pressure, LVSP)、左心室舒张末期压(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)、左心室压最大增率(maximum rate of increase of left ventricular internal pressure,+dp/dtmax)和左心室压最大减率(maximum decrease rate of left ventricular internal pressure,-dp/dtmax)[9]。

2.3 样品采集与处理

将大鼠麻醉后称质量,心脏取血,以3 500 r·min-1、4 ℃离心10 min,收集血清,保存于-80 ℃用于检测血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌钙蛋白T(troponin T,TnT)水平和肌酸激酶MB(creatine kinase MB,CK-MB)活性;采集血样后,脱颈处死大鼠,取出完整心脏用于TTC染色(n=7);分离左心室(包括室间隔),称质量;收集大鼠左心室结扎处下方的心肌组织并用预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)洗去多余血液,分别保存于质量浓度为40 g·L-1的多聚甲醛和-80 ℃低温冰箱中,用于苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, HE染色法)、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbnent assay, ELISA)和免疫吸附试验(Western blotting)检测。

2.4 计算LVM/BM值

以左心室质量(left ventricular mass,LVM)/体质量(body mass,BM)值评估心肌重塑情况。

2.5 TTC染色检测心肌梗死面积

新鲜心脏于-20 ℃放置10 min后制备成厚4 mm的组织切片,立即全部置于用37 ℃ PBS配制的TTC染液中,温浴15 min后取出(梗死区域为白色),洗涤3次后拍照,用Image-Pro Plus 6.0软件计算心肌梗死面积。心肌梗死面积百分比=(梗死面积/总面积)×100%。

2.6 HE染色观察心肌组织结构

将心肌组织置于多聚甲醛中固定过夜,常规石蜡包埋并制备成厚4 μm的组织切片,二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化,苏木素染核3 min,盐酸乙醇分化10 s,氨水返蓝,流水冲洗后滴加伊红染色30 s,后经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后,置于光学显微镜下观察。

2.7 ELISA检测炎症及氧化应激指标

取心肌组织100 mg置于0.5 mL生理盐水中充分匀浆,以12 000 r·min-1离心10 min,取上清。设置对照品孔、样本孔和空白孔,分别将样品及对照品液加入相应的检测孔内,抗体包被,洗板,加入酶结合物工作液,洗板,加入显色工作液,加入终止液终止反应,于450 nm波长处测定各孔的吸光度(A)值,以对照品质量浓度作为横坐标、对应的A值作为纵坐标,绘制对照品线性回归曲线,计算IL-6、TNF-α和MDA的含量及SOD和GSH-Px的活性。

2.8 检测心肌AMPK/FOXO1轴蛋白的表达水平

取心肌组织,置于研钵内碾碎,移至预冷裂解液中裂解,以12 000 r·min-1离心10 min,取上清。测定蛋白浓度后加热,使蛋白变性,SDS-PAGE凝胶电泳(浓缩胶60 V,25 min;分离胶120 V,65 min),转膜(200 mA,120 min),质量浓度0.05 mg·mL-1脱脂牛乳封闭PVDF膜,一抗(1∶1 000)4 ℃孵育15 h;1×TBST洗膜30 min,二抗(1∶8 000)室温孵育2 h,1×TBST洗膜30 min,ECL试剂与PVDF膜反应2 min,曝光后用Image J软件分析条带的灰度值,以β-actin为内参。目的蛋白的相对表达水平=目的蛋白条带的灰度值/β-actin条带的灰度值。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 LVM/BM值

5组大鼠LVM/BM值比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较,模型组的LVM/BM值升高(P<0.05);与模型组比较,3个给药组的LVM/BM值降低(P<0.05);与TFS低剂量组比较,TFS高剂量组和辅酶Q10组的LVM/BM值降低(P<0.05),辅酶Q10组的LVM/BM值最低(P<0.05)。结果见表1。

表1 各组大鼠LVM/BM值的比较

3.2 大鼠心脏血流动力学参数变化

5组大鼠LVSP、LVEDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠的LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均降低,LVEDP升高(P<0.05);与模型组比较,3个给药组大鼠的LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均升高,LVEDP降低(P<0.05);与TFS低剂量组比较,其他2组大鼠的LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均升高,LVEDP降低(P<0.05),辅酶Q10组的变化更明显(P<0.05)。结果见表2。

表2 各组大鼠心脏血流动力学参数变化的比较

3.3 大鼠心肌组织梗死面积

TTC染色结果显示,假手术组大鼠心肌组织呈均匀的玫瑰红色,模型组大鼠的心肌可见明显大范围的白色梗死灶,3个给药组心肌白色梗死区域均有缩小,4组大鼠心肌梗死面积比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,3个给药组大鼠心肌的梗死面积缩小(P<0.05);与TFS低剂量组比较,TFS高剂量组和辅酶Q10组大鼠心肌梗死的面积缩小(P<0.05),辅酶Q10组最小(P<0.05)。结果见图1、表3。

图1 各组大鼠心脏组织梗死范围观察

表3 各组大鼠心肌梗死情况的比较

3.4 大鼠心肌组织形态变化

HE染色结果显示,假手术组大鼠心脏的组织结构完整,心肌细胞排列规则、整齐;与假手术组比较,模型组大鼠的心肌细胞连接松散,排列紊乱,间质炎性渗出明显增多;与模型组比较,TFS低、高剂量组和辅酶Q10组大鼠心肌细胞的形态逐渐规则,结构逐渐完整,细胞排列逐渐有层次,炎性浸润逐渐减轻。结果见图2。

图2 各组大鼠心脏组织HE染色结果 (×400)

3.5 大鼠血清心肌损伤指标

生化分析结果显示,5组大鼠LDH、TnT水平和CK-MB活性比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠LDH、TnT的水平和CK-MB的活性升高(P<0.05);与模型组比较,3个给药组LDH、TnT的水平和CK-MB的活性降低(P<0.05);与TFS低剂量组比较,TFS高剂量组和辅酶Q10组LDH、TnT的水平和CK-MB的活性降低(P<0.05),辅酶Q10组最低(P<0.05)。结果见表4。

表4 各组大鼠血清LDH、TnT水平和CK-MB活性的比较

3.6 心肌组织炎症及氧化应激指标因子水平

ELISA结果显示,5组大鼠心肌组织IL-6、TNF-α、MDA含量及SOD和GSH-Px活性比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织IL-6、TNF-α、MDA的含量增加,SOD和GSH-Px的活性降低(P<0.05);与模型组比较,3个给药组IL-6、TNF-α、MDA的含量降低,SOD和GSH-Px的活性升高(P<0.05);与TFS低剂量组比较,TFS高剂量组和辅酶Q10组心肌组织IL-6、TNF-α、MDA的含量降低,SOD和GSH-Px的活性升高(P<0.05),且辅酶Q10组的变化最明显(P<0.05)。结果见表5。

表5 各组大鼠心肌组织IL-6、TNF-α、MDA含量及SOD和GSH-Px活性的比较

3.7 大鼠心肌组织中AMPK、FOXO1蛋白及磷酸化蛋白的相对表达水平

Western blotting结果显示,5组大鼠心肌组织中AMPK蛋白相对表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05),p-AMPK、p-FOXO1和FOXO1蛋白相对表达水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与假手术组比较,模型组p-FOXO1蛋白的相对表达水平升高,p-AMPK和FOXO1蛋白的相对表达水平降低(P<0.05);与模型组比较,3个给药组p-FOXO1蛋白的相对表达水平降低,p-AMPK和FOXO1蛋白的相对表达水平升高(P<0.05);与TFS低剂量组比较,TFS高剂量组和辅酶Q10组大鼠心肌组织中p-FOXO1蛋白的相对表达水平降低,p-AMPK和FOXO1蛋白的相对表达水平升高(P<0.05),辅酶Q10组的变化最明显(P<0.05)。结果见表6、图3。

表6 各组大鼠心肌组织AMPK、p-AMPK、FOXO1、p-FOXO1蛋白表达水平的比较

4 讨论

本研究通过结扎大鼠心脏左冠状动脉降支构建MI大鼠模型。当大鼠出现脉搏减弱、心电图ST段抬高、心肌组织有明显大范围梗死且组织结构发生病理改变时,表明建模成功。模型大鼠出现LVM/BM值显著升高,表明心室壁增厚,提示MI大鼠可能发生了左心室重构[10]。经低、高剂量TFS干预后,模型大鼠心肌组织的结构异常有所改善,心肌梗死面积显著缩小,LVM/BM值显著降低,表明TFS可能通过改善MI大鼠的心肌病理损伤减轻心室重构。

心脏缺血期间增加的ROS可导致细胞膜破损、脂质过氧化物产生及抗氧化防御系统破坏,当心肌膜失去完整性时,LDH和CK-MB从受损组织扩散到血液中,为心肌组织损伤的诊断标志物[11],TnT是心肌特有的收缩蛋白,是心肌功能障碍的重要生物标志物,尤其是在MI中[12]。本研究结果显示,模型组大鼠血清LDH、TnT的水平及CK-MB的活性显著升高,表明MI大鼠心肌细胞损伤并发功能障碍。心脏血流动力学参数可以直接反映整个心动周期左心室的压力变化,常用于评价左心室的收缩和舒张功能[13]。LVEDP是反映左心室前负荷的指标,其与心室收缩前的回血量和心脏射血功能有关。+dp/dt受心脏后负荷和心肌收缩力的影响,是评价心肌收缩力的重要指标。-dp/dt主要受心肌舒张前负荷的影响。当心肌收缩和舒张功能受到抑制时,±dp/dt、LVSP降低,LVEDP上升[14]。本研究结果显示,模型组大鼠LVSP、±dp/dt显著降低,LVEDP显著升高,表明MI大鼠心肌收缩及舒张功能受损;而经低、高剂量FPS治疗后,模型大鼠的血清LDH、TnT水平及CK-MB活性显著降低,LVSP、±dp/dt显著升高,LVEDP显著降低,表明FPS可能通过改善MI大鼠心肌组织损伤减轻心室重构进而促进心肌收缩及舒张功能的恢复。

氧化应激是MI的主要决定因素,其首先影响梗死的心肌,其次影响未梗死的心肌,研究表明,抗氧化剂治疗可抑制心肌的氧化应激,减轻心室重构和炎症反应,IL-6、TNF-α为促炎因子,在MI中两者的水平均升高[15]。胞膜脂质的氧化损伤由自由基引起,自由基可以产生MDA,对抗氧化损伤的防御反应主要由抗氧化酶(如GSH-Px、SOD)介导[16]。本研究结果显示,模型组大鼠心肌组织中IL-6、TNF-α及MDA的含量均升高,GSH-Px、SOD的活性降低,表明MI大鼠心肌组织病理损伤、心功能障碍及心室重构可能与氧化应激水平增强并促进炎症因子的表达有关;经低、高剂量的FPS治疗后,可逆转此情况,表明FPS可能通过抗氧化应激发挥一系列心功能保护作用。

AMPK是细胞能量稳态的主要调节剂,在营养缺乏或氧化应激等条件下被激活[17],由其介导的FOXO1磷酸化对于维持FOXO1的稳定性和核定位至关重要[18]。磷酸化状态下,FOXO1不能进入细胞核,并以泛素依赖性方式在细胞质中降解,去磷酸化的FOXO1定位于细胞核并显示出转录活性[19],研究发现,AMPK激活可抑制FOXO1的磷酸化,从而促进FOXO1蛋白发生核移位,提高FOXO1蛋白的活性,进而降低细胞氧化应激水平[20]。本研究结果显示,在模型组大鼠的心肌组织中p-FOXO1蛋白的相对表达水平显著升高,p-AMPK和FOXO1蛋白的相对表达水平显著降低,表明MI大鼠的AMPK/FOXO1轴被抑制;而在FPS低、高剂量组大鼠的心肌组织中p-FOXO1蛋白的相对表达水平显著降低,p-AMPK和FOXO1蛋白的相对表达水平显著升高,表明FPS可能通过激活AMPK促进细胞质中p-FOXO1的去磷酸化并发生核移位,进而激活FOXO1蛋白的转录活性,从而发挥抗氧化损伤的作用。

综上所述,FPS可改善MI大鼠心肌组织的病理损伤,降低炎症因子的水平,减轻心室重构,改善心肌收缩及舒张功能障碍,其作用机制可能与激活AMPK/FOXO1轴、提高MI大鼠抗氧化应激水平有关。