四季抗病毒合剂及其主成分抗肠道病毒71型的作用及机制研究

赵利娟,赵 荣,张 俏,何 悦,许 璐,王四旺,肖会敏*

1.陕西中药研究所(陕西医药信息中心),咸阳 712000;2.陕西海天制药有限公司,咸阳 712000;3.陕西省中药与天然药物研发重点实验室,西安 710075;4.陕西含光生物科技有限公司,西安 710032;5. 西北大学生命科学与医学部,西安 710069

手足口病多发于婴幼儿,是一种常见的病毒性传染病[1]。肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)是导致手足口病重症及死亡的主要病毒,可造成神经细胞、T淋巴细胞及人血管内皮细胞凋亡[2-3],甚至导致脑炎、脑水肿、脊髓灰质炎样麻痹等疾病。近年来,该病毒严重威胁学龄前儿童的健康。由陕西海天制药有限公司生产的四季抗病毒合剂(Siji Kangbingdu Mixture,SJM)具有清热解毒、消炎退热的功效,可用于治疗上呼吸道感染、病毒性感冒、手足口病等。临床研究报道,SJM治疗儿童手足口病疗效显著[4-5],甚至优于利巴韦林[6-7]。连翘酯苷A、连翘酯苷B、连翘苷、甘草苷、甘草酸、木犀草苷、绿原酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸是SJM的主成分(principal component,PC),也是主要功效成分[8-9]。尽管目前的EV71灭活疫苗可预防手足口病,但仍无特效治疗药物。因此,研制高效、低毒的抗EV71药物是对抗手足口病的关键。本研究旨在探讨SJM及其PC抗EV71增殖和感染的作用及其潜在机制,为手足口病的临床治疗提供依据,为老药新用奠定理论基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Multiskan FC微孔板读数仪、1300 Series A2型Thermo ScientificTM生物安全柜均购自美国Thermo Scientific公司;MKS-112型独立通风笼盒系统(苏州市猴皇动物实验设备科技有限公司);D180-P型二氧化碳培养箱(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);CKX53倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 试药

四季抗病毒合剂(国药准字Z20027669,批号181226)由陕西海天制药有限公司生产,每瓶含原生药174.6 g(0.97 g·mL-1×180 mL),临用前用DMEM培养基稀释至所需质量浓度;PC组成见表1,连翘酯苷A(批号111810-201606)、连翘酯苷B(批号111811-201603)、绿原酸(批号110753-201716)、连翘苷(批号110821-201615)、甘草苷(批号111610-201607)、甘草酸(批号110731-201619)、木犀草苷(批号111720-201609)、1,3-二咖啡酰奎宁酸(批号111717-201402)、3,5-二咖啡酰奎宁酸(批号111782-201405),均购自中国食品药品检定研究院;细胞培养及动物腹腔注射用试药均经0.22 μm微孔滤膜除菌;利巴韦林注射液(国药准字H19999077,批号1805198,规格为每支0.1 g×1 mL),由陕西顿斯制药有限公司生产,临用前用DMEM培养基稀释至所需质量浓度;DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司;MTS 细胞增殖定量检测试剂盒购自美国Promega公司;二甲基亚砜、溴化二甲噻唑二苯四氮唑均购自美国Sigma公司;9 mg·mL-1氯化钠溶液购自陕西圣奥动物药业有限公司。

表1 SJM的PC组成

1.3 实验动物

7日龄SPF级ICR乳鼠,购自空军军医大学实验动物研究中心,实验动物生产许可证号为SCXK(陕)2014-002;动物实验操作遵守中国科技部2006年颁布的《关于善待动物的指导性意见》(国科发财字[2006]398号)。

1.4 细胞与病毒株

非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)购于中国协和医科大学基础医学研究所基础医学细胞中心;肠道病毒71型(EV71)购于美国典型菌种保藏中心。

2 方法

2.1 细胞病变效应法测定EV71毒力及EV71 RNA检测

取适量EP管,分别加入90 μL无血清DMEM培养基。将准备好的EV71原液吹打混匀后吸取10 μL置于1号EP管中(稀释10-1),吹打混匀后从中吸取10 μL置于2号管(稀释10-2),以此类推逐个稀释至8号管(稀释10-8)。将各稀释度的病毒一次接种至已长好Vero细胞的96孔板中,同时设置空白组和正常组,每组沿纵向设置6个复孔,置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养,于倒置显微镜下观察并记录细胞病变效应。当细胞病变效应达90%以上时终止培养,弃去培养液,逐孔加入溴化二甲噻唑二苯四氮唑溶液,继续培养4 h,弃去培养液并加入二甲基亚砜,待沉淀结晶完全溶解后,用酶标仪于490 nm处测定吸光度(A)值,计算半数组织培养感染剂量(TCID50):细胞存活率=[(病毒组A值-空白组A值)/(正常组A值-空白组A值)]×100%;细胞比距=[(高于50%病变率-50%)/(高于50%病变率-低于50%病变率)]×100%;TCID50=Antilg(lg高于50%细胞病变效应百分率病毒稀释度+比距×稀释因子对数)。

当细胞病变效应达到75%以上时收集病毒裂解液,提取EV71的RNA,经RT-RCR法检测。步骤参考相关文献进行[10],反应结束后,取PCR反应产物,用琼脂糖凝胶电泳检测病毒的目的片段。

2.2 SJM与PC对Vero细胞的毒性

MTS法测定:将Vero细胞接种于96孔板中,每孔细胞数为1×104个,对照组加入等量DMEM培养基,四季抗病毒合剂组(按生药量计为97.00、48.50、24.25、12.13、6.07、3.04、1.52、0.76、0.38 mg·mL-1)、PC组(按连翘酯苷A计为0.17、0.085、0.042 5、0.021 25、0.010 6、0.005 31、0.002 66、0.000 66 mg·mL-1)按剂量分组处理,每组10个复孔,于37 ℃培养箱中培养72 h,按说明书操作,用酶标仪于490 nm处测定A,计算各给药组的细胞存活率。

2.3 SJM与PC对ICR乳鼠的急性毒性

取7日龄ICR乳鼠72只,将其随机分为6组,分别为单次对照组(腹腔注射氯化钠溶液0.1 mL)、连续对照组(腹腔注射氯化钠溶液0.1 mL,每日1次,连续给药15 d)、四季抗病毒合剂单次组[腹腔注射32.32 g·kg-1SJM(按生药量计)0.1 mL]、四季抗病毒合剂连续组(腹腔注射32.32 g·kg-1SJM 0.1 mL,每日1次,连续给药15 d)、PC单次组[腹腔注射56.64 mg·kg-1PC(按连翘酯苷A计)0.1 mL]、PC连续组(腹腔注射56.64 mg·kg-1PC 0.1 mL,每日1次,连续给药15 d),每组12只。观察并记录每只乳鼠的精神状态、行为、饮食、死亡等情况。

2.4 SJM与PC体外抗EV71活性

参照文献方法[11],将Vero细胞随机分为32组,每组5个复孔,分别为正常组、模型组(感染75 TCID50与50 TCID50EV71的Vero细胞)、四季抗病毒合剂组(感染75 TCID50与50 TCID50EV71的Vero细胞给药剂量按生药量计为4 850、2 430、1 220、610、300、150、80 μg·mL-1)、PC组(感染75 TCID50与50 TCID50EV71的Vero细胞给药剂量按连翘酯苷A计为8.50、4.25、2.13、1.06、0.53、0.27、0.13 μg·mL-1)。

2.5 SJM与PC体内抗EV71活性

将156只ICR乳鼠随机分为13组,每组12只,模型乳鼠腹腔注射毒力为1×107TCID50·mL-1的EV71 0.1 mL(参照文献方法造模[11])。正常组(腹腔注射等量氯化钠溶液)、模型组(腹腔注射等量氯化钠溶液)、利巴韦林组(10 mg·kg-1)、四季抗病毒合剂组(按生药量计为3 232、1 616、808、404、202 mg·kg-1)、PC组(按连翘酯苷A计为5.66、2.83、1.42、0.71、0.35 mg·kg-1);造模2 h后开始腹腔注射给药,连续给药15 d,每日1次,每次0.1 mL;每日记录存活动物数与体质量,计算平均存活时间、存活率、临床评分值(按文献中的方法[12]评价)等参数。

2.6 肌肉匀浆液与血清中炎症因子检测

按照BD cytometric bead array mouse inflammation kit说明书,参考文献[11]检测EV71感染乳鼠肌肉匀浆液与血清中白细胞介素-6(interleukin 6, IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)的水平。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 EV71毒力测定

研究结果表明,EV71对Vero细胞的TCID50为10-5.68·mL-1。该病毒被RT-PCR扩增后得到了特有的226 bp条带,表明该病毒为EV71。

3.2 SJM与PC对Vero细胞的毒性

各组的SJM与PC对Vero细胞的存活率及抑制率见表2,按Reed-Muench计算,SJM与PC对Vero细胞的半数抑制质量浓度分别为11.83 mg·mL-1(按生药量计)、20.67 μg·mL-1(按连翘脂苷A计)。

表2 不同质量浓度SJM与PC对Vero细胞的抑制作用 (n=10)

3.3 SJM与PC对ICR乳鼠的急性毒性

ICR乳鼠腹腔注射32.32 g·kg-1SJM或56.64 mg·kg-1PC 15 d后,单次组与连续组均未出现死亡,与相应对照组相比,乳鼠精神状态、饮食、活动等情况,无明显异常,且合群、无炸毛、毛色有光泽,表明32.32 g·kg-1SJM与56.64 g·kg-1PC单次和连续腹腔注射对7日龄ICR乳鼠均无明显致毒作用。

3.4 SJM与PC体外抗EV71活性

研究结果表明,SJM与PC均能剂量依赖性抑制EV71的增殖。SJM与PC在高质量浓度时能显著提高感染EV71的Vero细胞的存活率和保护率,各梯度质量浓度的SJM与PC组均能不同程度地减少EV71对Vero细胞造成的病变与死亡。见表3。

表3 不同药物对感染EV71后的Vero细胞的存活率与保护率的影响 (n=5)

3.5 SJM与PC体内抗EV71活性

研究结果表明,EV71感染ICR乳鼠分别注射不同剂量的SJM或PC可显著延长乳鼠的存活时间。四季抗病毒合剂组与PC组乳鼠的存活时间、存活率及临床评分均优于模型组,且呈剂量依赖性改善,甚至优于利巴韦林组。见表4、表5。临床评分值按文献方法[12]评价,即正常为0分;行为异常或离群为1分;竖毛、易激、狂躁为2分;仅上肢麻痹僵硬,运动能力减弱,体质量下降为3分;下肢或四肢完全瘫痪、共济失调,失去运动能力为4分;濒死为5分。模型组乳鼠从第3天开始出现精神萎靡、稀便等病态反应,至第8天全部死亡。3 232、1 616、808 mg·kg-1四季抗病毒合剂组和5.66、2.83、1.42 mg·kg-1PC组及利巴韦林组治疗初期(0～5 d)症状明显改善,四季抗病毒合剂组比相当量的PC组改善情况略好,后期病情恶化直至死亡。综上所述,SJM与PC均能显著改善手足口病模型乳鼠的临床症状,均可显著抑制EV71的增殖。

表4 SJM与PC对接种EV71的ICR乳鼠的存活状况的影响

表5 SJM与PC抗接种EV71的ICR乳鼠的临床评分 (n=12)

3.6 SJM与PC对炎症分子的调节作用

感染EV71的手足口病模型乳鼠于6 d后取肌肉、血清,检测肌肉匀浆液与血清中的炎症因子水平,结果表明,SJM与PC可有效调节乳鼠IL-6、TNF-α、MCP-1的水平,且差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。见图1。SJM的调节效果略优于PC。该结果表明,SJM与PC是通过调节机体免疫系统和炎症因子水平抗EV71从而缓解和治疗手足口病的。

注:A.IL-6;B.TNF-α;C. MCP-1;与对照组比较,**P<0.01,*P<0.05。

4 讨论

SJM为国家食品药品监督管理总局批准的标准制剂[批准文号为WS-11454(ZD-1454)-2002-2012Z],具有清热解毒、消炎退热的功效,主治小儿呼吸系统疾病、病毒性感冒、手足口病等[3-4],其由连翘、桑叶、鱼腥草、菊花、薄荷、荆芥、桔梗、紫苏叶、苦杏仁、芦根和甘草11味中药组成。

君药之一连翘,透邪清热、芳香辟秽、解毒;君药之二鱼腥草,清解肺热、化痰排脓;君药之三桑叶,疏散上焦风热、清宣肺热、凉润肺燥。3味君药相须为用,疏散风热、清热解毒、宣肺止咳。臣药之一桔梗,宣肺、利咽、祛痰、排脓;臣药之二菊花,散风清热、平肝明目、清热解毒;臣药之三苦杏仁,降气止咳平喘、润肠通便。3味臣药和合,清泄肺热解毒、宣降肺气复清肃,可增强君药清热宣肺之力。佐药之一薄荷,佐君臣疏散风热、清利头目、利咽、透疹、通鼻窍;佐药之二荆芥,解表散风、透疹、消疮;佐药之三紫苏叶,解表散寒、行气和胃,与荆芥佐连翘发汗逐外邪;芦根,清热泻火、生津止渴,与佐药同用以消散主兼症;桔梗,宣肺利咽、祛痰排脓;甘草,补脾益气、清热解毒、去痰止咳、缓急止痛、调和诸药,与桔梗合用,兼具佐使之功。全方合用,疏风透表、清热解毒、宣肺止咳。

本研究建立的EV71感染细胞和ICR乳鼠模型,可用于研究SJM与PC治疗手足口病的药效与机制。研究表明SJM与PC具有显著体内、外抗EV71的作用,4 850、2 430、1 220 μg·mL-1SJM与8.50、4.25、2.13 μg·mL-1PC可显著提高感染细胞的平均存活率(P<0.05或P<0.01)和平均保护率;二者亦可呈剂量依赖性提高感染乳鼠的存活率并延长存活时间(P<0.05或P<0.01),3 232 mg·kg-1SJM与5.66 mg·kg-1PC组感染乳鼠的存活时间长于利巴韦林组(P<0.05或P<0.01)。前期的研究结果表明SJM治疗手足口病具有显著疗效[4-5],本研究将PC组与四季抗病毒合剂组联合研究,佐证了PC在SJM治疗手足口病中的重要贡献。PC中的连翘酯苷A、连翘酯苷B、连翘苷是君药连翘的主要药效成分[13-14];绿原酸、1,3-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸是君药菊花的主要药效成分[15];绿原酸可有效抑制大部分病毒[16];二咖啡酰奎宁酸可有效抗炎、抗病毒、调血脂[17];甘草具有抗病毒、抗菌、消炎、解毒、减毒的作用[18-19],甘草苷、甘草酸是其主要药效成分[20]。这些重要成分使得PC具有较好的抗EV71的效果。机制研究结果表明,SJM与PC均具有良好的免疫调节作用,可有效调节重要炎症因子IL-6、TNF-α、MCP-1在肌肉与血清中的水平,这可能是SJM与PC抗EV71型手足口病的潜在作用机制。同时也证明了PC是SJM中不可或缺的化合物,是SJM抗手足口病的药效物质基础。但是PC不等同于SJM,PC仅是活性成分的组合,SJM则是11味中药组成的复方制剂,其按照君臣佐使原则相配伍,多成分多靶点相互关联,以整体发挥药效,这可能是SJM抗手足口病的效果略优于PC的重要原因。