基因芯片和RNA-seq 联合组织芯片分析CLDN8 在乳头状肾细胞癌的表达及意义

张观兰，李建棣，杨艺洲，许静婕，陈思智，杨小萱，陈 罡，李生华

肾细胞癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，主要有透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）、乳头状肾细胞癌（papillary renal cell carcinoma，PRCC）和嫌色细胞肾细胞癌3 个亚型；其中PRCC 是第二常见的亚型，约占所有肾细胞癌的10%～15%[1，2]，好发于60 ～80 岁老年人群，男性患者多见。 有研究表明局限性的PRCC 预后比ccRCC 的好，但转移的2型PRCC 预后较转移的ccRCC 差。 由于临床上以ccRCC 较为常见， 肾癌的临床研究以ccRCC 为主，PRCC 多数的诊断与治疗模式都来自于ccRCC 相关的研究，但PRCC 的独特特征可能对原发性和转移性PRCC 的诊断和治疗有一定影响[3，4]。因此，探索PRCC的相关特征有一定意义。

Claudin-8（CLDN8）是一种参与构成紧密连接的跨膜蛋白， 通过形成膜内原纤维构成紧密连接的骨架，其羧基末端的PDZ（postsynaptic density-95/discslarge/zona occludens 1，PSD95-Discs large-ZO1） 结构能与其他紧密连接蛋白分子相互作用，从而固定在紧密连接复合体上[5]，在维持紧密连接的结构和功能中发挥重要作用。 目前，CLDN8 的异常表达已被证实与多种肿瘤有关，如ccRCC、视网膜母细胞瘤、乳腺癌等。 研究表明CLDN8 在ccRCC 中为低表达， 认为CLDN8 可通过上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）通路抑制ccRCC 细胞进行增殖、迁移和侵袭[6]。 CLDN8 在视网膜母细胞瘤中低表达，miR-361-5p 通过miR-361-5p/CLDN8 轴负调控CLDN8 的转录和翻译水平，从而抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖并诱导视网膜母细胞瘤细胞死亡[7]。 另外，CLDN8 在乳腺癌中低表达且与雄激素受体表达呈正相关关系，但其在乳腺癌中明确调控机制仍有待完善阐明[8]。

目前尚无相关研究报道CLDN8 在PRCC 中的作用。 笔者拟通过实施免疫组织化学染色检测CLDN8蛋白表达强度， 并收集全球范围内公共数据库中PRCC 的mRNA 表达数据集， 计算CLDN8 mRNA 表达水平，结合癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中患者的临床病理参数进一步分析CLDN8 表达在PRCC 中的临床价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Gene Expression Omnibus （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/） 数据库、Sequence Read Archive（https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/） 数据库和ArrayExpress 数据库（https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/）集合了全球范围内各研究的基因芯片和高通量测序数据集，是公认的生物医学数据库。 实验拟通过以上数据库筛选PRCC 的mRNA 数据集， 检索时间是建库至2021年6月1日。

1.2 方法

1.2.1 获取基因芯片及RNA 测序数据

检索Gene Expression Omnibus 数据库、Sequence Read Archive 数据库和ArrayExpress 数据库， 获取RPCC mRNA 表达数据集。 检索式为：“papillary renal cell carcinoma”or“PRCC”。

选择标准：①数据集来源物种是智人；②mRNA测序； ③同时具有癌样本和对照样本， 癌样本为PRCC 组织， 对照样本为癌旁组织或正常肾组织，癌样本、对照样本数目均≥3。

排除标准：①数据集来源是细胞系；②经过基因敲除或药物处理的样本。

此外，通过R 包TCGAbiolinks 获取TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/）数据库中PRCC 经RNA 测序的计数数据集（时间截至2021年7月12日）。 最后，对没有标准化的数据集进行log2（x+1）归一化处理，得到6 个数据集用于后续分析。

1.2.2 组织芯片

通过免疫组织化学染色（immunohistochemical staining，IHC）来检测CLDN8 蛋白在PRCC 的表达情况，实验使用的组织芯片购买自桂林泛谱生物技术有限公司（中国），包括15 例PRCC 样本和16 例非肿瘤样本。IHC 实验结果根据染色强度和阳性细胞所占比例进行综合评定[9]。 每个样本取5 个高倍镜视野。

判断标准如下： ①染色强度记为0、1、2、3 分，分别表示阴性、弱、中、强；②阳性细胞比例为0 记0 分，1%～25%记1 分，26%～50%记2 分，51%～75%记3 分，76%～100%记4 分； ③染色强度与阳性细胞比例评分数值的乘积即为对应视野的最终得分，最后平均5 个视野的评分作为该样本的最终得分。汇总31 个样本的最终得分作为第7 个数据集用于下一步的统计学分析。

1.2.3 分析方法

通过GraphPad Prism v8.0.2 软件（GraphPad Prism version 8.0.2 for Windows，GraphPad Software，San Diego，California USA。www.graphpad.com）进行非配对两独立样本t 检验， 分析CLDN8 在PRCC 组织与非PRCC 组织的表达差异，绘制散点图和受试者工作特性（receiver operating characteristic curve，ROC）曲线获得真阳性数（true positive，TP）、真阴性数（true negative，TN）、 假阳性数 （false positive，FP）、 假阴性数（false negative，FN）。

Q 检验和I2可分别定性、定量进行异质性检验，若Q 检验有统计学意义（P＜0.10），表明研究存在统计学异质性；I2≤40%时异质性可忽略不计；30%≤I2≤60%表明存在一定程度的异质性；I2≥50%异质性较明显。 当Q 检验P＜0.10 且I2＞50%时，合并效应量SMD 选用随机效应模型， 否则采用固定效应模型。

通过Stata v12.0 软件（StataCorp. 2011. Stata Statistical Software:Release 12）合并标准化均数差（standardized mean difference，SMD）效应量，计算灵敏度、特异度、似然比，绘制汇总受试者工作特性（summary receiver operating characteristic，SROC）曲线及发表偏倚检验漏斗图。 SMD 用于反映CLDN8 在各数据集的总体表达水平。

2 结果

2.1 基因芯片和RNA-seq 数据集

最终从公共数据库筛选出6 个数据集，包括5 个基因测序数据集（E-MTAB-1805、GSE7023、GSE11151、GSE15641、GSE26574）和1 个RNA 测序数据集（TCGA-KIRP）。 流程见图1。

图1 mRNA 数据集筛选流程图Fig.1 Flow chart of mRNA dataset screening

2.2 CLDN8 在乳头状肾细胞癌表达

根据非配对两独立样本t 检验结果，CLDN8 mRNA 表达水平在PRCC 组织较非PRCC 组织低（表1）。免疫组织化学染色后， 在光学显微镜下观察可见，CLDN8 蛋白定位于细胞浆， 在PRCC 呈弱阳性表达（图2）。 CLDN8 蛋白表达差异有极显著统计学意义（P＜0.000 1）。

表1 各数据集的病例数、TP、FP、FN、TNTab.1 Number of cases,TP,FP,FN and TN of each data set

2.3 数据异质性检验

Q 检验结果显示P＜0.01，I2为95.4%， 统计学异质性显著，森林图采用随机效应模型。

2.4 CLDN8 表达水平合并效应量SMD

7 个数据集中CLDN8 表达水平合并效应量SMD为－ 6.80，95 % CI － 8.97 ～－ 4.63。 说明CLDN8 在PRCC 有显著低表达趋势（图3）。

图3 CLDN8 在PRCC 低表达的合并标SMDFig.3 Pooled SMD of CLDN8 low expression in PRCC

2.5 数据偏倚分析和效能分析

Deeks’漏斗图（P = 0.15，图4A）和Egger’s 漏斗图（P=0.231，图4B）提示发表偏倚不显著。 SROC 曲线下面积（area unde curve，AUC）趋近于1.00（95%CI 0.99 ～1.00）， 表明CLDN8 对于PRCC 具有较高的判断效能，灵敏度为0.99（95%CI 0.93 ～1.00），特异度为0.99（95%CI 0.83 ～1.00），阳性似然比为103.39（95 % CI 5.16 ～2 069.90），阴性似然比为0.01（95%CI 0.00 ～0.08）（图5、6）。 CLDN8 的表达量与患者的临床病理特征无明显关联（表2）。

表2 CLDN8 mRNA 表达水平与PRCC 临床病理特征的关系Tab.2 Relationship between CLDN8 mRNA status and PRCC clinical pathologic features

图4 CLDN8 数据集Deeks’ 漏斗图（A）和Egger’s 漏斗图（B）发表偏倚检验Fig.4 Funnel plots of Deeks’(A)and Egger’s(B)publication bias tests for CLDN8 dataset

图5 CLDN8 的诊断试验评价Fig.5 Diagrams of diagnostic test evaluation of CLDN8

3 讨论

PRCC 发病率仅次于ccRCC[2，10]。 随着二代测序技术和分子医学的发展， 越来越多的研究投入到生物学标志物和分子靶向治疗中， 以提高临床诊治疾病的效率。 特别地，肾癌是一组具有不同组织学类型、分子和基因突变的高异质性肿瘤，因此为临床个体化治疗寻找有效的生物学标志物是迫切需要的， 也符合精准医学的发展方向[1，11]。 Claudins 是一种参与构成紧密连接的跨膜蛋白[5]，具有栅栏、分子信号传导和屏障功能。 近年来，有研究报道Claudins 蛋白可通过信号传导参与肿瘤发生过程，也与炎症应答、细胞恶性增生、上皮间质转化、肿瘤转移相关[12]。CLDN8 作为Claudins 蛋白家族的一员，也以相似的途径参与着恶性肿瘤的发生、发展过程，但其在PRCC 中的作用并未阐明。笔者通过收集大样本测序数据集和开展免疫组织化学染色实验，分别从转录组水平和蛋白质水平分析了CLDN8 在PRCC 中的表达水平， 得出了CLDN8 在PRCC 显著低表达的结论。

共485 例PRCC 样本和95 例对照样本的mRNA测序数据用于检测CLDN8 在转录组水平的表达差异，15 例PRCC 样本与16 例对照样本用于CLDN8蛋白表达验证。mRNA 测序数据集和组织芯片的结果均表明CLDN8 在PRCC 具有极显著下调趋势 （P＜0.000 1）。 SROC 曲线提示CLDN8 具有较高的判断效能，发表偏倚不显著。 在笔者研究中，CLDN8 低表达与患者性别、年龄、种族、肿瘤分期均无明显关联。 由此提出CLDN8 在PRCC 异常下调现象， 并有可能在PRCC 的发生及进展中发挥一定的促进作用。

已有研究证明CLDN8 异常表达与多种恶性肿瘤相关，CLDN8 在ccRCC 中为低表达， 可通过EMT 和PKB 通路抑制ccRCC 细胞进行增殖、 迁移和侵袭[6]。在视网膜母细胞瘤，miR-361-5p 通过靶向抑制CLDN8 的表达可起视网膜母细胞瘤抑制作用[7]，在乳腺癌中CLDN8 也为低表达且与雄激素受体表达呈正相关关系[8]。另外，CLDN8 很有可能是KMT2C 在前列腺癌发挥致癌作用的下游基因[13]。 笔者研究通过转录组水平和蛋白水平证实了CLDN8 在PRCC 也呈现异常低表达的趋势，其具体机制未知。笔者提出，CLDN8下调可能与PRCC 的发生、发展有关。

当然， 笔者研究也存在一定的局限性， 如纳入mRNA 数据集和临床病理样本数不多、异质性来源不清楚、 没有明确揭示CLDN8 参与PRCC 的机制。 因此， 还有赖于更多的研究来揭示CLDN8 在PRCC 异常低表达的分子机制。

（致谢： 感谢广西医学病理学重点实验室提供计算病理学及临床病理学技术支持）