3D 生物打印技术在心脏组织工程中的研究进展

王占磊，金 健

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是指影响心肌、 心脏瓣膜或体内血管受损的一种病理进程，在CVD 终末期， 通常需要进行器官置换以改善患者预后[1，2]。目前，用于CVD 治疗的置换器官通常来源于患者自身、捐赠者、动物、合成移植器官等。 但是以上置换器官均存在局限性， 如缺乏现成的供体器官、抗凝治疗、免疫排斥、持久性有限等[3]。 因此临床上迫切需要通过其他途径来治疗CVD。 目前，心脏组织工程（cardiac tissue engineering，CTE）通过生物材料将干细胞分化成成熟的功能组织，以支持组织的正常生长和发育，从而修复受损的血管、心脏瓣膜和心肌[4]。同时，CTE 的另一个优势是能够降低移植物的免疫排斥反应、抑制血栓形成[4]。

在CTE 快速发展的形势下，3D 打印技术（threedimensional bioprinting technology）应运而生，它能够按照一定的空间顺序精确地将生物材料和活性细胞逐层沉积叠加到具有复杂3D 结构的打印支架中，从而产生高度连续稳定的生物工作模式，高度模拟心脏工作状态，为心肌组织修复与再生提供保障[5]。 目前，基于3D 生物打印技术的心脏再生技术仍处于早期探索阶段，需要更多领域完善合作，进一步精确地表达心肌结构和生理病理特点。 文章将对3D 生物打印技术在CTE 中的研究进展进行探讨。

1 心脏解剖学及心肌病

对于哺乳动物， 心脏是体循环和肺循环的交叉点，靠近心尖的部分被室间隔分成左右心室，上面部分被房间隔分成左右心房。心脏的肌纤维群尤其是沿心室壁纵向、横向和斜向运动的心肌组织，在心肌的收缩期和舒张期完成射血和充盈具有重要作用[6]。 心肌微结构为心肌外层组织是一层纤维心包，其主要功能是定位整个心脏的解剖位置；往内是心包腔，是由浆膜性心包的脏层与壁层相互移行所形成的密闭裂隙，可容纳心包液用于润滑或者减轻心脏收缩时产生的摩擦力；靠近心外膜层的是心肌层，即心脏的核心功能单元，含有条纹心肌细胞和丰富的血管；心脏的最内层为心内膜，可影响心肌的内部收缩力。 含有胶原蛋白的细胞外基质分布在上述各层间隙中，从而组成完整的心脏[7]。

众多因素可引起心脏结构和/或功能病理的改变，如冠状动脉缺血性心脏病、严重的先天性心脏病、某些细菌或病毒感染引起的心脏功能障碍等[8]。 临床上，心脏移植是终末期CVD 治疗的首选，但因供体的稀缺性和不可避免的免疫排斥反应，往往难以保证心脏移植患者的长期生存率[9]。 因此迫切需要深入探索CTE 在临床应用的转化，如利用3D 生物打印技术形成可工作的心肌，延长终末期CVD 患者的生命。

2 3D 打印技术在心血管疾病中的临床应用

关于CVD， 特别是在先天性心脏病领域，3D 生物打印技术可用于医学生教育、改善医患沟通、辅助心脏病医生或心脏外科医生处理复杂心脏疾病，以及用于开发治疗心脏瓣膜疾病的医疗设备等用途。

使用3D 生物打印技术可以对冠心病（coronary artery heart disease，CAD） 患者进行术前精确规划。Lau IWW 等[10]报道了3D 生物打印技术在CAD 治疗术前规划中的作用，其可以辅助外科医生确定最佳的手术方案，协助手术流程顺利进行，特别是用于处理复杂的CAD 病例。Xu J 等[11]研究报道，借助针对患者病情特定的3D 生物打印模型，可以制订个性化的治疗策略和最佳的手术方案。 Tuncay V 等[12]报道3D 生物打印模型在心脏瓣膜病的治疗和左心耳封堵术方面发挥了重要作用， 可用于心脏瓣膜疾病的术前规划﹑手术培训和器械测试与开发。 Wang C 等[13]分析了多项关于3D 生物打印模型在成年人CAD 手术或导管介入治疗中的应用，研究表明3D 生物打印技术在成年人CAD 中的临床应用较多， 主要用于心血管手术的辅助治疗。

此外，3D 生物打印技术还可用于经导管主动脉瓣置换术 （transcatheter aortic valve replacement，TAVR）的术前规划和模拟。 Thorburn C 等[14]评估3D生物打印模型在心脏瓣周漏（paravalvular or perivalvular leakage，PVL） 治疗中的潜在价值，TAVR 植入后，将打印好的模型连接到一个封闭的压力系统进行评估。 最后，将3D 打印模型测量的PVL 与TAVR 患者的超声心动图检测的PVL 进行比较， 结果显示两者之间存在显著相关性，说明利用3D 生物打印模型预测TAVR 患者的PVL 具有潜在价值。 Haghiashtiani G等[15]进一步将3D 打印的主动脉模型进行优化，通过CT 图像创建两个患者特异性的主动脉根部模型，每个模型都包括主动脉壁、心肌、主动脉瓣叶和钙化区，使用4 种生物墨水打印代表不同的解剖结构，同时设计生物瓣膜假体模拟TAVR 治疗。结果显示，3D 生物打印模型能在不同心脏术后期准确预测患者解剖学和身体行为；而且，血流动力学分析表明带有内部传感器的3D 打印模型在预测传导干扰方面具有潜在价值，可以降低TAVR 手术相关风险，从而有助于开发新型医疗设备。

此外，3D 打印技术还可用于冠状动脉异常的治疗，3D 冠状动脉模型在模拟冠状动脉介入手术、 指导复杂冠状动脉疾病的治疗方面具有重要意义；3D 冠状动脉模型的另一个应用是提高对冠状动脉异常的认识。Lee M 等[16]研究显示3D 冠状动脉打印模型可以增强对冠状动脉解剖和病理的了解， 比单纯CT 图像更有用。此外，研究表明，3D 冠状动脉模型在其他领域也有应用，比如向患者解释病情、改善医患沟通；通过向临床医生展示诊断解剖学，为心脏外科医生制定术前计划等。3D 冠状动脉模型还可用于制定冠状动脉支架置入术中的钙化斑块和冠状动脉腔的最佳CT 扫描方案。研究[17，18]表明，通过构建3D 冠状动脉模型，将6 种不同直径的支架放置在冠状动脉内模拟冠状动脉支架植入术，CT 扫描结果显示此方法能显著提高支架和支架管腔的可视性，可以清晰地看到支架位置与冠状动脉解剖的关系。3D 冠状动脉模型也可以模拟冠状动脉的血流， 反映CAD 发展过程中血流动力学的变化。 Sommer KN 等[19]通过制作3D 冠状动脉模型模拟冠状动脉远端阻力和顺应性，在流速为80 ～160 mL/min 时，成功测量了3 个主要冠状动脉（包括右冠状动脉、左前降支和左旋支）的压力，结果显示以上主要冠状动脉的腔阻力可以忽略不计。 此研究开发了一种创新的利用3D 打印模型模拟真实的冠状动脉生理血流的方法，从而可以进一步全面分析和模拟冠状动脉血流变化。

3 3D 生物打印模型结构的构建

病变或受损心脏组织进行3D 生物打印之前，首先要创建患者特定的3D 模型。 目前常用的3D 模型成像技术包括心脏计算机断层扫描（electrocardiography-gated computer tomography, CT）、3D 超声心动图和心脏磁共振成像 （cardiac magnetic resonance，CMR）。 因CT 和3D 超声心动图的局限性，CMR 图像广泛用于3D 打印模型[20]。

将CT、CMR 或3D 超声心动图成像数据收集到的信息转换成患者特定的3D 心血管组织数字模型，这一过程称为“图像分割”。 早期的图像分割仅基于CT 图像采集的数据， 但近期研究表明也可以利用CMR 图像采集的数据复制先天性心脏病和全身血管疾病[21]。 Farooqi KM 等[22]通过将3D 超声心动图和超声心动数据进行分析，使二尖瓣瓣叶和瓣环重建具有可行性。 首先，将获得的CT/CMR 的图像数据集导出为医学数字成像与通信（digital imaging and communication in medicine,DICOM）格式，基于像素阈值强度对目标的几何解剖进行识别和分割；下一步“堆叠”单个心脏组织的2D 图像，以便将同一强度范围内的像素分组，并用单一材料进行打印；最后，转换成患者特定的3D 数字心脏模型， 并保存为标准镶嵌式语言（.stl）文件，以便进行修改和调整，最后导出用于3D生物打印[21]。

4 心脏组织工程生物墨

因水凝胶具有生物相容性、生物可降解性，并可为发育中的组织提供机械支持， 因此在CTE 中常使用水凝胶模拟原组织中的3D 细胞外基质；而且交联水凝胶具有高度的多孔性， 允许细胞迁移和支架填充， 并允许营养物质输送到细胞以满足其代谢需求。此外，由于大多数水凝胶表现出黏弹性，是生物打印过程中生物墨水的理想选择。常用的天然高分子水凝胶包括胶原、明胶、透明质胶、壳聚糖、透明质酸、纤维蛋白、海藻酸、纤维素等。心脏组织的生物打印主要利用以下生物材料作为生物墨水。

4.1 海藻酸盐

海藻酸盐是海藻酸的盐类，是由（1→4）-β-交联的D-甘露糖醛酸和（1→4）-α-交联的古洛糖醛酸组成的长链聚合物， 其含量和分布因聚合物的长度不同；因其生物特性，海藻酸盐不能与细胞黏附。 因此，将海藻酸盐作为生物墨水时，必须在其上面覆盖支持心脏组织发育的细胞黏附部分，如肝素结合肽（heparin-binding peptide，HBP）或基质凝胶。 与未修饰的海藻酸盐支架相比，海藻酸盐支架上固定精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-asparttate，RGD）多肽后可以促进心肌组织的生成[23]。 海藻酸盐作为生物墨水能够为心肌细胞的生长提供环境；还可以通过调节聚合物的交联程度调节材料的机械性能。Zisch AH等[24]利用细胞负载的改性海藻酸盐作为生物墨水进行生物打印以制造人类胎儿心肌细胞构建物，研究结果表明， 细胞与海藻酸盐支架具有良好的黏附性，并能模拟天然的心脏细胞外基质。

4.2 明胶

明胶是将猪、鱼等动物的皮肤、骨骼和结缔组织中提取的胶原蛋白部分水解得到的一种水溶性蛋白质。因明胶具有生物降解性、生物相容性、有限的免疫原性及低成本的特点，在心血管组织工程领域得到了广泛的应用[25]。Anilkumar S 等[26]开发了一种新型可见光交联明胶-透明质酸水凝胶用于生物打印技术，植入小鼠间充质干细胞、小鼠成肌细胞或小鼠胚胎成纤维细胞， 可使细胞在培养5 d 后仍保持活力和功能，此研究结果表明明胶可能用于制造心脏组织。

4.3 纤维蛋白

纤维蛋白是一种天然的生物可降解聚合物，可从患者自身血浆中提取， 因此可以构建完全的自体支架，不存在发生免疫原性反应的风险。 纤维蛋白支架在构建心脏瓣膜、心肌、主动脉导管和血管等心血管结构方面具有重要优势[27]。 据报道，在成年大鼠股动脉和股静脉周围植入携带纤维蛋白凝胶悬浮液和大鼠心肌细胞的硅胶管3 周后，管内组织与正常心肌组织相似[28]，此研究结果表明纤维蛋白在用于打印心脏组织方面具有重要意义。

4.4 胶原蛋白

胶原蛋白凝胶可作为打印心脏组织的生物墨水，如心肌细胞在胶原蛋白内黏附和增殖良好，可以种植内部支架结构[29]。Lee VK 等[30]将胶原蛋白作为生物墨水用于连接两个血管通道的毛细血管，为3D 生物打印的心脏组织提供毛细血管网络，使氧气和营养物质能够到达支架包围的细胞。 因此，胶原蛋白可广泛用于心脏组织的3D 生物打印技术。

5 总结与展望

综上所述，作为一种快速发展的生物技术，3D 打印技术在医学不同领域的应用越来越广泛。 3D 打印模型的应用为多种CAD 患者提供更多治疗方案，增强了临床医生对复杂疾病的理解和对复杂手术的信心。 随着3D 打印技术的发展和打印材料的改进，在不久的将来，3D 打印技术在CTE 中应用会越来越广泛，有利于患者的护理和临床实践。