电针头部运动区穴位对亚急性MPTP模型小鼠机械痛阈的干预

彭晶晶 朱本藩 李俊 李珊珊 朱四欢 肖顺东 杨志来 许二赫

(1安徽中医药大学第一附属医院神经内科,安徽 合肥 230031;2安徽医科大学第一附属医院疼痛科;3安徽中医药大学;4安徽医科大学第一附属医院麻醉科;5首都医科大学宣武医院)

帕金森病(PD)通常表现为运动与非运动症状〔1〕。疼痛是PD临床实践中常被忽略的一种重要的非运动症状,可早于运动症状出现之前多年〔2〕,是PD早期阶段的一个重要特征〔3〕。疼痛是PD的一种常见且日益公认的非运动症状,其患病率在 40%～85%,并随着疾病进展而患病率增加〔4,5〕。临床上通常把PD疼痛分为肌肉骨骼疼痛、肌张力障碍相关疼痛、神经根性疼痛、静坐不能引起疼痛及原发性或中枢性PD疼痛〔6〕。PD的疼痛可能与运动症状的影响无关〔5,7〕,有研究认为PD疼痛的严重程度与运动并发症、自主神经症状、焦虑和抑郁症的严重程度存在微弱的相关性,而中枢敏化的特征明显〔5〕。多巴胺能药物可以部分患者改善症状〔5〕,提示多巴胺缺乏可能是PD相关疼痛发生的重要原因〔7〕。中医针灸已逐渐被世界各国所接受〔8〕。头针疗法是通过针刺头部的特定区域以治疗各科疾病的一种微针系统疗法。头皮电针是在头针针具上通接近人体生物电的微量低频脉冲电流,利用针和电两种刺激相结合治疗疾病的方法,对各种疼痛疗效明确〔9〕,被广泛用于治疗各种疼痛包括PD疼痛〔10〕,但目前电针改善PD疼痛的机制尚不清楚。本实验拟通过1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)腹腔注射构建亚急性PD相关疼痛小鼠模型,观察电针是否可以提高PD模型小鼠机械痛阈及可能的机制。

1 材料与方法

1.1实验材料动物 实验动物:雄性C57BL/6J小鼠30只,8周龄,SPF级,体质量18～25 g,购自杭州子源实验动物科技有限公司,生产许可证号:SCXK(浙)2019-0004,动物合格证号:20220227Abzz-005000574。适应性饲养于安徽中医药大学第一附属医院动物房,饲养室温度控制在(22±2)℃,12 h明暗交替,自由摄食饮水。实验试剂:MPTP造模剂(Selleck),4%多聚甲醛(PFA),抗酪氨酸羟化酶(TH)单克隆抗体(三鹰),舒泰50(Virbac),二甲苯(天津市凯通化学),无水乙醇(上海广诺化学),柠檬酸盐修复液、磷酸盐缓冲液(PBS)、过氧化物酶封闭液、抗小鼠/兔二步法检测试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、苏木素染液、中性树胶(ebiogo)。实验仪器:电子 Von Frey 压力测痛仪,旷场实验视频分析系统Super Maze2.0, 低频脉冲电子针灸治疗仪(华佗牌),一次性无菌针灸针(0.25 mm×25 mm),生物组织自动脱水机、生物组织包埋机(湖北亚光),徕卡切片机、切片刀(Leica),电热恒温鼓风干燥箱、隔水式恒温培养箱(上海三发),电磁炉(Midea),高压锅(SUPOR),PAP Pen 免疫组化笔、黏附载玻片(ebiogo),显微镜(OLYMPUS),自制爬杆,自制小鼠头部固定器(已申请专利,专利号:CN202220053210.7)。

1.2实验分组与造模 小鼠适应性喂养1 w后,随机分为3组:对照组、模型组、电针组各10只。模型组和电针组按照30 mg/kg 剂量腹腔注射MPTP的方法建立PD小鼠模型,每日1次,连续5 d,对照组给予等体积生理盐水。造模成功后,固定小鼠头部,参照中国针灸学会实验针灸研究会制定的动物针灸穴位图谱和《实验针灸学》〔11〕,选取焦氏头针双侧运动皮层区域;用一次性无菌针灸针(0.25 mm×25 mm),向对侧眼球方向进针,深度3 mm;电针参数:0.8～1.0 mA,疏密波,2/15 Hz,20 min,电流强度以小鼠安静无躁动,耳郭轻度抖动或局部肌肉收缩为度。

1.3行为学测试 爬杆试验:取一条长50 cm、直径2 cm的缠有医用纱布的木杆,作为实验用爬杆。将装置垂直放置,小鼠头部向上轻轻放置于木杆顶部,观察并记录小鼠掉头后从杆顶向下到双前肢接触杆底的时间,测3次取平均值。如果爬杆途中出现停滞或者反向攀爬则需重新测定。

旷场试验:该实验在安静环境下进行。实验前将小鼠放在实验房间适应30 min,实验时放置于旷场箱(50 cm×50 cm)中心,采用视频追踪系统观察小鼠在5 min内的活动情况。观察指标主要包括运动总路程和平均速度。每只小鼠观察前,需清洗旷场箱内壁及底面,以避免上一个小鼠残留的大小便及气味的影响。

机械刺激伤害感受阈:将小鼠置于玻璃箱中30 min,底部为0.5 cm×0.5 cm 孔径的铁丝网。待小鼠安静后,使用电子 von Frey 压力测痛仪测定小鼠左足底跖侧皮肤直至抬腿或主动缩足,测得机械缩足阈值(用 g 表示)。每只小鼠测定 3 次,每次相隔 5 min,取平均值。

1.4免疫组织化学法检测小鼠黑质酪氨酸氢化酶(TH)的表达 实验小鼠麻醉后开胸暴露心脏,PBS缓冲液心尖灌注,直至肺变成白色,停止灌注,完整取脑,PBS冲洗,放入4% PFA固定,生物组织包埋机包埋及连续脑组织冠状切片,切片放入干燥箱66 ℃烤片20～30 min,依次过3道二甲苯,每道5 min,依次过3道(100%-95%-80%)乙醇,每道3 min ,将切片放入烧杯中,流水缓慢冲洗,洗去乙醇,直到切片干净透明,在高压锅内配制2 000 ml pH为6.0的柠檬酸盐修复液,电磁炉加热至沸腾,放入切片盖上锅盖,喷气后计时2 min,然后停止加热,流水缓慢冲洗高压锅盖直至冷却,切片放入3%H2O2中室温孵育,蒸馏水洗3次,画疏水圈,PBS-T冲洗3次,甩去切片上多余的液体,滴加二抗,加盖置于37 ℃培养箱孵育30 min。取出切片,PBS-T冲洗3次,甩去切片上多余的液体,滴加DAB显色剂,显微镜下控制显色时间,有阳性终止显色,蒸馏水冲洗干净,苏木素衬染2～5 min,水洗干净;1%盐酸酒精分化数秒,水洗干净碳酸锂溶液蓝化30 s,水洗干净,常规脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜观察结果。

1.5统计学方法 采用SPSS26.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1电针对PD模型小鼠行为学的影响 在爬杆试验中,与对照组〔(4.00±0.58)s〕相比,模型组爬杆总时间〔(5.25±1.25)s〕明显延长(t=-2.719、P=0.015);与模型组比较,电针组爬杆总时间明显缩短〔(3.62±0.91)s,t=3.161、P=0.006〕。在旷场试验中,与对照组〔(24.26±4.65)m〕相比,模型组运动总路程〔(12.54±3.75)m〕明显缩短(t=5.887、P<0.000 1),平均速度明显减慢〔(0.08±0.02)m/s、(0.04±0.01)m/s,t=5.853、P<0.000 1〕;与模型组比较,电针组运动总路程较模型组明显延长〔(17.53±3.80)m,t=-2.809、P=0.013〕,平均速度明显提高〔(0.06±0.01)m/s,t=-2.978、P=0.009〕。

2.2电针对PD模型小鼠机械刺激伤害感受阈的影响 与对照组〔(3.10±0.21)g〕相比,模型组机械刺激伤害感受阈值明显降低〔(2.18±0.31)g,t=7.409,P<0.000 1〕;与模型组相比,电针组机械刺激伤害感受阈值明显升高〔(2.66±0.34)g,t=-3.180,P=0.006〕。

2.3电针对PD模型小鼠TH表达的影响 与对照组(0.79±0.01)比较,模型组TH表达显著减少(0.16±0.04,t=31.087、P=0.001);与模型组比较,电针组TH表达显著增多(0.33±0.08,t=-3.257、P=0.031)。见图1。

图1 3组脑黑质TH表达(SP染色,×200)

3 讨 论

本研究结果表明,电针可以改善亚急性MPTP/PD疼痛模型小鼠的运动症状;电针可以提高亚急性MPTP/PD疼痛模型小鼠机械刺激伤害感受阈;电针可以减少亚急性MPTP/PD疼痛模型小鼠的多巴胺能神经元的凋亡。

目前电针在全球广泛使用,可以缓解包括伤害性疼痛和神经病理性疼痛在内的各种疼痛〔12,13〕。其中,头针镇痛效果好且可持续一段时间〔9,13〕。既往临床研究中已经证实,针刺对于PD疼痛有明显的止痛作用〔14,15〕。动物研究表明电针可以逆转因疼痛诱导而下调的酪氨酸羟化酶TH、多巴胺、D1和D2受体浓度,显著降低坐骨神经慢性收缩性损伤诱导的疼痛(CCI)大鼠模型中杏仁核中的酸性蛋白GFAP、炎症因子TNF-α和IL-1β,从而达到改善疼痛的目的〔12〕。电针可以调控败血症小鼠坐骨神经和迷走神经调节肾上腺中释放多巴胺,由多巴胺抑制炎症因子释放,介导新的抗炎机制〔16〕。

PD中存在着参与疼痛处理结构的功能障碍,包括脊髓背角、中脑中央灰质、脑干伤害性下行抑制结构、基底节和皮层结构〔17〕。其中,基底神经节包括黑质、豆状核、尾状核及丘脑底核等结构,参与上行和下行中枢疼痛处理,多巴胺减少导致疼痛阈值降低〔18〕。基底节的疼痛输入可能被认为来自两个主要来源:(1)来自疼痛传入系统的直接(例如,脊柱-基底节)和间接(如脊柱-丘脑-基底节)途径;(2)来自皮质和皮质下脑区域〔19〕。基底节对疼痛刺激的传入起整合作用〔20〕。在苍白球及丘脑底核等为靶点的深部脑刺激可以改善PD疼痛〔21,22〕。

既往的研究发现黑质毁损会引起PD模型小鼠的机械与热痛敏反应升高,提示多巴胺缺乏导致痛觉过敏和疼痛,而纹状体多巴胺能系统的激活在大鼠中具有镇痛作用〔23～26〕。 MPTP及6-羟基多巴胺(OHDA)诱导的PD相关疼痛动物模型中均可发现疼痛阈值明显降低,疼痛敏感性增强〔27,28〕,而在给予左旋多巴后这些动物模型的疼痛敏感性恢复,提示多巴胺可能参与疼痛的改善机制中〔28〕。在既往PD啮齿动物模型中已经证实,针刺对多巴胺能神经元具有保护作用〔29〕。机制可能涉及多个靶点。大量动物实验证实,针刺涉及多巴胺神经元线粒体功能障碍、氧化应激、蛋白质聚集、凋亡、自噬受损、肠道菌群和神经炎症等多方面的调节〔29～31〕。

综上,亚急性MPTP/PD疼痛小鼠模型中,电针可以通过抑制多巴胺神经元的凋亡,从而改善PD模型小鼠机械痛敏反应。说明多巴胺神经递质仍然是PD相关疼痛改善的关键靶点,对PD相关疼痛的诊断和治疗具有重要的指导作用。