醒脑灌肠液联合健脾益智胶囊对脑卒中大鼠TrkB表达、运动功能、Notch1信号的影响

张晓冬 尹金磊 籍胤玺 关素珍 郭磊 黄蕾 傅国惠

(南阳市中心医院,河南 南阳 473009)

脑卒中是临床常见的脑部疾病之一。缺血性脑卒中是脑部动脉内出现斑块,持续性诱导海马组织出现氧血不足,也有部分患者是由于机体内栓子类物质循环进入脑部血管,紊乱脑部供血功能,血液流量减少,导致海马组织出现氧气和供血不足等事件发生〔1〕。由于医疗水平提升,老年化程度增加,导致脑卒中的患病人数持续增加。目前,临床中,对于该病的治疗要采用具体分析,对症治疗,虽然在一定程度上缓解病情,但是在另一方面也延长了患者的治疗时间〔2〕。原肌球蛋白受体激酶(Trk)B主要分布在海马区域,对大鼠脑部疾病变化较为敏感〔3〕。研究人员在脑部病变大鼠体内检测到Notch1信号异常表达,首次将Notch1与脑部、神经等疾病联系起来〔4〕。Notch1表达水平在人体神经性疾病中占重要地位。Notch1是很多关键信号的交汇点,该信号能直接激活相关转录因子的表达〔5〕。但在脑卒中、脑梗死等多种脑部疾病中Notch1的作用机制还较为模糊。现代药理研究显示,醒脑灌肠液具有通腑泄热、涤痰逐瘀、醒脑开窍之功效,能够起到扩张血管、增加脑血流量、减少微栓塞的作用〔6〕。研究显示,脑与脾二者在机体生命活动中相互制约又相互依赖,采用健脾、滋补类药物治疗后阿尔茨海默病大鼠的记忆、学习能力得要明显改善,因此,猜测健脾益智胶囊可能对脑卒中大鼠有治疗作用〔7〕。本研究旨在探讨醒脑灌肠液联合健脾益智胶囊对脑卒中大鼠TrkB表达、运动功能、Notch1信号的影响。

1 材料与方法

1.1一般材料 在青岛市药品检验所购买40只健康雄性SD大鼠,体质量220～270 g,鼠龄3～4 w。将所选取的大鼠随机分为模型组(M组,制作脑卒中模型)、对照组(D组,仅在颈部动脉处做小切口)、醒脑灌肠液组(X组,建立缺血性脑卒中模型后给予醒脑灌肠液);健脾益智胶囊组(J组,建立缺血性脑卒中模型给予健脾益智胶囊)、醒脑灌肠液联合健脾益智胶囊组(L组,建立缺血性脑卒中模型后给予醒脑灌肠液联合健脾益智胶囊),每组6只。

1.2模型制备 常规麻醉大鼠,颈部正中切口,找到颈内动脉,参照 Longa 线栓法〔8〕,选取规格为2.0 cm×0.2 mm的阻塞线,将阻塞线插入至大脑中动脉的入口,缺血3 h后拔线栓,血管结扎,创口缝合、消毒。麻醉清醒后观察其行为学改变,采用Longa评分标准〔9〕进行选择,0级:行为无明显变化;1级:左前肢屈曲,左后肢伸展;2级:有左侧追尾现象,左转圈;3级:行走困难,摇摆不定;4级:意识不清。将评级为1、2、3级的纳入实验。

造模成功后,X组给予醒脑灌肠液,取0.5～1.0 ml水煎剂(浓度为2 g/ml,每剂水煎100～200 ml,根据成人体重及剂量换算得出)经大鼠肛肠深部缓慢滴入肠内,每日1次。J组给予健脾益智胶囊混悬液15 ml/(kg·d)灌胃,每日1次,L组同时给予健脾益智胶囊、醒脑灌肠液治疗,连续治疗3 w。所有大鼠生存环境相同。各组模型制备成功后进行相关实验,完成后处死,开颅取海马组织用于相关指标测定。醒脑灌肠液由石菖蒲、郁金15 g、大黄、水蛭10 g、冰片3 g组成;健脾益智胶囊由白术、黄芪20 g、何首乌15 g、人参10 g、远志、石菖蒲6 g及水蛭3 g组成。

1.3仪器与试剂 Step one plus PCR仪(生物应用,美国);氯仿(江苏千胜,中国);兔抗人TrkB、Notch1抗体(上海北诺,中国)。

1.4神经功能评分 采用Carcia评分〔10〕评定各组神经功能,分别从自主活动、网屏试验等6个方面进行评分,评分为3～18分,得分越低,神经功能越差。

1.5运动功能 使用大鼠抓力计对各组大鼠的左前肢抓力进行测试。选用倒三角形抓杆,抓杆后方连拉力传感器,抓杆高度始终保持一致,将大鼠置于实验台上,当向后拉鼠尾时,大鼠抓住抓杆,继续向后拉鼠尾直到实验人员的拉力超过大鼠前肢的最大抓力,仪器将自动记录大鼠在整个抓握过程中最大的抓力(单位:g)。测试5次,取平均值。

1.6组织免疫化学染色法检测大鼠海马组织中TrkB蛋白阳性表达情况 去大鼠大脑海马组织,做切片常规脱蜡、水化,加阻断过氧化物酶,PBS 漂洗,加一抗 TrkB(1∶150),孵育,漂洗,加二抗,重复以上步骤,甩干后滴加DAB显色剂,苏木素,脱水、透明、封片,观察。

1.7Western印迹检测Notch1蛋白含量 将海马组织进行裂解并提取核蛋白,并对核蛋白的浓度进行测量,分装后,保存在-20 ℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液照4∶1的比例进行混合,然后将其煮沸,变性。蛋白加脱脂奶粉放聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,封闭。加入1抗,TTBS漂洗3次,加2抗,封闭1 h。TTBS漂洗,DAB显色,拍照。

1.8实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测TrkB、Notch1 mRNA表达量 把保存在-80 ℃环境中海马组织取出,研磨,提取总RNA,进行逆转录。所有反应严格按照反应的条件进行扩增,内参采用GAPDH,变性3 min 95 ℃,变性5 s 95 ℃,退火1 min 60 ℃,共进行40次。引物序列:TrkB:上游引物:5′-GAACGACAACCCGACATT3-3′、下游:5′-AGACGTGGATCTGGAGTGA-3′,Notch1:上游引物:5′-GGCG-AACGCACGTT3-3′、下游:5′-GAGACACGCGCGCGT-3′,GAPDH:上游引物:5′-TGGACTCTACTGGCG-TCTT-3′、上游:5′-TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3′,取得平均值后得到Ct值,计算方法用2-ΔΔCt法进行分析。

1.9统计学分析 采用SPSS22.0软件进行方差分析,组间两两比较采用t检验。

2 结 果

2.1大鼠神经功能评分及运动功能比较 各组在神经功能及运动功能评分存在时间、组间相互作用(P<0.01)。与M组相比,X、J、L、D组治疗后第10、21天的神经功能评分、运动功能均明显升高(P<0.05);与X组及J组相比,L、D组治疗后第10、21天的神经功能评分、运动功能均明显升高(P<0.05),且D组明显高于L组(P<0.05)。M、X、J、L组在治疗后第1天的神经功能评分及运动功能比较均差异无统计学意义(P>0.05),但D组与其他各组比较两个指标均明显升高(P<0.05);组内不同时间相比,各组均随着时间的升高神经功能评分及运动功能均明显增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组神经功能评分及运动功能比较

2.2组织免疫化学染色法检测TrkB蛋白阳性表达 M组、X组、J组、L组及D组海马组织中TrkB蛋白阳性数目分别为(19.52±1.05)、(23.40±1.22)、(24.06±1.09)、(42.71±4.20)及(63.55±6.07)个,组间差异显著(P<0.05)。D组海马组织的TrkB阳性蛋白数最高,M组TrkB蛋白阳性数目最低,与M、X、J、L组比较,L组TrkB阳性数目显著升高(均P<0.05)。X、J组体内TrkB阳性数差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 TrkB蛋白阳性表达(苏木素染色,×200)

2.3Western印迹检测Notch1蛋白含量 M组、X组、J组、L组及D组海马组织中Notch1蛋白表达分别为0.57±0.14、0.58±0.13、0.60±0.10、0.68±0.22及0.85±0.19,组间差异显著(P<0.05)。D组海马组织的Notch1蛋白含量最高,M组含量最低,与M、X、J、L组相比较,D组海马组织中Notch1蛋白含量显著升高(均P<0.05)。X组、J组海马组织中Notch1蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 Western印迹检测各组海马组织中Notch1蛋白表达

2.4qRT-PCR法检测TrkB、Notch1 mRNA表达量 D组海马组织的TrkB、Notch1 mRNA表达量最高,M组mRNA表达量最低,与M、X、J、L组比较,D组海马组织TrkB、Notch1 mRNA表达显著升高(均P<0.05),X组、J组海马组织中TrkB、Notch1 mRNA表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组海马组织中TrkB、Notch1 mRNA表达量

3 讨 论

缺血性脑卒中是最常见的脑卒中类型,缺血性脑卒中是由于海马组织出现长时间的氧血不足引起脑部疾病。目前,由于组织缺血缺氧造成了广泛的皮质和皮质下损伤,遗留下各种功能障碍,包括:感觉运动功能、吞咽障碍等,其中,以感觉运动功能障碍最为多见〔11〕。缺血性脑卒中临床表现为海马组织出现病变,神经功能丧失、运动、语言出现障碍等症状。因此,该病的发现时间与治疗时间与患者预后呈正相关关系,越早的治疗,越能控制病情的发展,对治疗该病有显著作用〔10〕。

文献报道,脑卒中会使患者出现偏瘫、运动功能障碍等相关并发疾病,现今,有许多药物可以达到治疗效果,但西药长时间服用存在一定副作用,本文从两种不同疗效中药对脑卒中大鼠模型进行试验,探究中药对脑卒中的改善效果及机体作用机制〔12〕。大鼠前肢精细运动功能评价是脑卒中后治疗及康复手段神经功能评价的重要研究方向。前肢的感觉-运动综合反应是由感觉系统和运动系统共同参与的复杂神经调控,除了前肢运动空间定位,还受到视觉、嗅觉、自我情感等多种因素调控〔13〕。本研究结果表明,醒脑灌肠液与健脾益智胶囊对脑卒中大鼠的神经系统及肢体恢复均有一定作用,但单一药物治疗效果欠佳,两种药物联合治疗,能够同时发挥药效,从不同方向进行作用。本研究结果与Taiping等〔14〕研究结果相符,在大鼠脑卒中发生后及时给予醒脑灌肠液进行治疗,能够显著缓解大鼠因脑部缺血所导致的神经症状,减轻运动障碍,恢复前肢运动能力。研究显示〔15〕,健脾益智胶囊中白术、石菖蒲、水蛭等中草药能够对脑卒中患者的机体状态、器官功能、临床症状等方面有显著改善作用,恢复患者日常生活能力。实验研究结果显示〔16〕,健脾益智胶囊方中人参、黄芪具有强健脾气、益智宁神、通畅血运、以养五脏的功效,何首乌、石菖蒲、水蛭有豁痰醒脑、交通心肾、可补五脏之不足、健脾之功效。健脾益智胶囊对脑卒中昏迷具有显著效果,未见明显不良反应。醒脑灌肠液具有通腑泄热、涤痰逐瘀、醒脑开窍之功效。其中,大黄苦寒,能通腑泻下,引火下降;郁金性味辛苦、凉,行气解郁、凉血破淤;冰片能很快透过血脑屏障,增加血脑屏障通透性,起到醒脑开窍的作用;水蛭减轻周围组织炎症反应的水肿,缓解颅内压,起到逐瘀开窍的作用〔17〕。现代药理研究显示,诸药具有扩张血管、降低血管阻力、减少毛细血管通透性、增加脑血流量、清除自由基、抑制血小板聚集、降低血黏度、减少微栓塞、改善血流动力学指标、改善肢体 运动功能障碍等作用〔18〕。

Notch信号通路在人体神经性疾病和机体发育中都发挥着重要作用,如介入并调整了细胞凋亡、侵袭、迁移及血管的产生等生理病理历程〔19〕。在不同疾病中,Notch可能通过抑制细胞增殖或诱导凋亡来体现自身作用。本研究表明,中药治疗脑卒中大鼠的作用机制可能与TrkB、Notch1等信号的表达水平存在一定的相关性。实验结果表明〔20〕,通过运动训练联合中药的干预,脑卒中大鼠的BDNF、TrkB蛋白表达受到了明显的影响,表明运动训练联合中药治疗相对于单一运动治疗脑卒中后可得到更好的治疗效果,运动训练联合中药治疗是治疗脑卒中的有效方法之一。实验表明〔21〕,脑卒中大鼠与正常大鼠相比较,体内TrkB、Notch1表达水平存在显著差异,表明TrkB、Notch1参与脑卒中的发生发展过程。研究发现〔22〕,醒脑灌肠液与健脾益智胶囊干预能够显著改善脑卒中大鼠的运动障碍,缓解前肢抓地情况,同时促进了海马组织中TrkB、Notch1的表达,继而推测,醒脑灌肠液与健脾益智胶囊治疗可能通过上调TrkB、Notch1表达来实现治疗脑卒中大鼠的运动障碍的作用。