兽用疫苗佐剂的研究进展

钱忠辉 张华弟 葛宇燕 张子悦 朱永军

摘  要：兽用疫苗免疫佐剂可以辅助兽用疫苗进入动物机体，增强疫苗的免疫效力，维持疫苗的稳定性，帮助疫苗更加有效地预防、控制动物传染病，减少损失，保障安全的生态环境。用作兽用疫苗免疫佐剂的物质越来越多，有水性疫苗佐剂和油性疫苗佐剂等，各种佐剂的有效成分和作用方式各不相同。本文就兽用疫苗佐剂的特点做了概述，以期为疫苗研发过程中佐剂的筛选提供参考。

关键词：兽用疫苗；疫苗佐剂；免疫应答

中图分类号：S859.79+9.9 文献标志码：A       文章编号：1001-0769（2023）03-0074-05

我国动物养殖业正朝着集约化规模化方向发展，但集约化发展的同时也导致动物传染病更易发生，在保障生物安全的前提下，需要研制具有安全性、有效性的兽用疫苗，用于防治畜禽疫病的发生流行，提高养殖效益。在疫苗制备过程中，选择合适的免疫佐剂非常重要。免疫佐剂简称佐剂，是一种自身不具备抗原特性的非特异性免疫增强剂，协同抗原预先或一起注入动物机体，可充分发挥抗原的免疫原性，进一步提高机体的免疫应答，或引起免疫反应类型发生改变的一类辅助性物质。因此，选择正确的佐剂，能有效减少抗原的使用量，降低疫苗的生产成本，提升疫苗的有效性。

佐剂这个词源自拉丁文。1925年，法国兽医加斯顿·拉蒙（Gaston Ramon）经过反复试验发现，当疫苗注射部位出现炎症时，动物机体会产生更好的免疫反应。随后他观察到，在疫苗中添加木薯粉、卵磷脂、琼脂、淀粉油、皂素等物质，可提高免疫效果，首次用“Adjuvant”来描述这种物质。开发安全有效的疫苗佐剂是一个漫长的过程，佐剂成分也经历了从天然成分到人工合成化合物的转变过程。随着生物技术的发展，新型疫苗的种类越来越多，佐剂发挥的作用机理也各不相同，新近发现的新型兽用疫苗佐剂的作用机制不断被提出。绝对安全、没有任何副作用的疫苗佐剂不存在。优势佐剂的筛选需要考量佐剂自身的优势与劣势，结合主体抗原的特点，尽可能地在免疫刺激作用最大化和毒副作用最低化之间取得一个平衡。疫苗佐剂之间没有明显的分类界限，无法进行系统而明确的划分，根据疫苗佐剂的成分性状不同，佐剂可分为油性佐剂和水性佐剂。

1  水性佐剂

1.1 矿物质佐剂

矿物质佐剂属于疫苗的传统佐剂之一，其中常见的铝盐佐剂是一种乳白色的冻胶状半固体，主要有氢氧化铝[Al（OH）3]、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾及钾明矾等，以Al（OH）3佐剂最为常用，是目前唯一被国际开发协会（International Development Association，IDA）批准的既可应用于人用疫苗又可应用于兽用疫苗的佐剂。氢氧化铝成本较为低廉，使用操作方便，通针性强，被广泛应用于兽用疫苗，特别是以菌苗为主的以抗体为保护性免疫的兽用疫苗。Glenny等在1926年首次发现，在兽用白喉外毒素疫苗中以铝盐作为佐剂，可有效增强动物机体对抗原的特异性免疫应答。然而，铝盐佐剂也存在一些局限性，包括引起局部反应，导致IgE抗体反应增强；对某些抗原无效以及无法增强细胞介导的免疫应答，如小分子蛋白，分子量小、免疫原性低，与氢氧化铝共同使用时，很难产生足够的抗体应答。

磷酸钙也是一种常见的矿物质佐剂，是构成机体的天然组成成分。最初由巴斯德研究所以轻基磷灰石[Ca10（PO4）6（OH）2]的形式开发，具有良好的组织相容性、生物降解性和可吸收性，无毒且廉价易得，目前已运用在对抗各种类毒素和病毒的疫苗生产中。有研究表明，与铝佐剂相比，磷酸钙对动物局部组织的刺激较小，lgE抗体产生减少。

1.2 蜂胶佐剂

蜂胶是一种天然的免疫增強剂，富含多种生物活性成分，主要含有各种维生素、酸类化合物、醇类化合物等，同时还含有钙、磷、镁、铁、锰等微量元素。蜂胶具有抑菌、消炎、促进动物局部组织再生等作用。蜂胶主要含有蜜蜂从植物中采集的花粉、树脂以及蜂蜡等，具有广谱抗病毒、抗细菌和抗霉菌等多种药理学活性作用，并具有免疫调节和提高机体免疫力的功能。给动物接种含有蜂胶佐剂的疫苗，可激活免疫活性细胞，如巨噬细胞的吞噬能力和自然杀伤细胞的杀伤作用，调整细胞免疫的发生。作为免疫辅助剂，蜂胶能显著刺激免疫球蛋白的产生，使血清总蛋白的含量增高，更好地发挥体液免疫。使用水性蜂胶作为佐剂的疫苗，可使动物机体以更快的速度产生抗体，且保护率高，安全性好，无毒副作用。

1.3 中药佐剂

有研究发现，迄今为止有200余种具有免疫增强作用的动植物中药佐剂。多糖是从中草药中提取的一种大分子物质，是植物细胞壁的重要组分，具有天然、无毒、无副作用的突出特点，对动物的体液免疫系统和细胞免疫系统可进行全方位的调节，因而可以用作低毒疫苗的免疫增强剂。在一定条件下，天然成分的多糖与抗原物质混合后会形成一种复合剂，通过刺激动物免疫器官自身细胞的生长发育和分裂增殖，激活巨噬细胞、淋巴细胞和自然杀伤细胞等，达到增强动物机体特异性免疫反应的效果，导致免疫器官重量成指数级增加，从而达到增强免疫反应的作用，稳定地发挥免疫增强剂的功能。多糖虽然安全、稳定，但因产地不同，采收时间差异较大，有效成分含量不确定；制作工艺尚不成熟，质量控制不确定，导致效果不稳定；生产过程烦琐，价格较高。这些因素制约了中药多糖佐剂的应用。

存在于多种植物中的皂苷类皂素及其三萜衍生物是另一种应用较为广泛的中药佐剂。作为天然产物，它们具有广泛的生物活性，进入动物机体后，可激活Ｔ细胞和抗原递呈细胞，免疫诱导各种免疫相关细胞的分化成熟，如促炎性1型辅助性T细胞（Helper T cells 1，Th1）/Th2免疫或抗炎性Th2，中性粒细胞的富集，以及巨噬细胞和树突状细胞（dendritic cell，DC）的分化成熟。皂苷作为疫苗佐剂，通过免疫调节和免疫刺激作用，能显著增强动物机体的免疫应答，延长疫苗的免疫保护周期，减少疫苗接种次数。皂苷还能刺激动物机体提高干扰素、肿瘤坏死因子等细胞因子的分泌水平，进一步发挥疫苗的有效性。但是，此类佐剂也存在明显的细胞毒性、神经毒性、溶血性，会改变肠道通透性，损害肝脏和肾脏。未来可以通过结构修饰，使皂苷达到减毒增效的目的，通过开发新的剂型，解决其溶血性和细胞毒性等问题，使其在疫苗应用中更加广泛。

1.4 细胞因子佐剂

细胞因子是由免疫原或其他诱导剂刺激动物机体的多种细胞而产生的，是一种低分子量的高活性多功能可溶性蛋白，通过与细胞表面受体相互作用，发挥调节细胞生长、修复损伤组织等多种功能，并可诱导免疫细胞发挥功能，明显增强固有免疫和适应性免疫。细胞因子作为疫苗佐剂可分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。

最早用作疫苗佐剂的细胞因子是白介素-1（interleukin 1，IL-1）。IL-1是淋巴细胞活化因子，由刺激物诱导巨噬细胞、单核细胞和其他多种组织细胞活化后分泌产生的一类激素样多肽，介导固有炎性反应，在抗感染免疫、免疫肿瘤细胞生长及维持机体内环境的平衡上起着重要作用，可增强动物机体的二次抗体应答。IL-1的佐剂活性与其注射的时间和剂量密切相关，表现为时间和剂量的依赖性，通常在免疫后注射IL-1可获得较好的活性。毒副作用最强的剂量，也是疫苗效果最好的剂量。有研究表明，由B细胞产生的IL-12是效果最好的细胞因子佐剂，是Th1分化和增殖、产生γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）以及与Thl型相关的免疫球蛋白所必不可少的。除此之外，IL-12可提高黏膜和体液免疫应答中IgG2a和IgA的水平，减少病原体的侵入。IL-12通过Th1型应答反应对细菌、肿瘤细胞和寄生虫抗原具有有效杀伤作用。目前，运用基因工程的方法，可生产各种细胞因子，大大降低了生产成本。但高剂量细胞因子会激活过多的效应因子，造成多余的中间物质泄漏，过量使用将破坏应答平衡，并导致非特异细胞活化的细胞因子，引起自身免疫病的发生。

1.5 脂质体

脂质体主要是脂质小囊，由磷脂和固醇类组成，既是免疫佐剂，同时也具备抗原载体的功能。脂质体表面的疏水结构和内部的亲水结构，使其具有广泛的适用性，既可包被亲水性抗原，又可包被亲脂性抗原，通过将抗原输送和递呈给合适的免疫细胞发挥佐剂作用。脂质体具有多种优点：天然靶向性佐剂，易定位于单核细胞丰富的器官；类细胞膜材料，无毒性，可被生物降解，没有残留，安全性高；对细胞膜有较好的亲和性，可将包被的抗原（或编码抗原的DNA）输送到细胞内，激活细胞和体液免疫应答反应；作为载体，携带半抗原，诱发动物机体对半抗原的免疫反应。脂质体能够降低被包被抗原的毒性，有效提高动物机体对免疫原的耐受，良好地巩固了抗原的稳定性；同时还能延长疫苗使用期，改善疫苗贮存条件。但是，脂质体分子含有不饱和脂肪酸链，在贮存时不稳定；脂质体的实验室制备技术虽已趋于成熟，但工业生产的制备工艺仍有待改进，大规模合成难，费用也较高。此外，脂质体对动物体内某些酶敏感，进入机体后不稳定；小脂质体倾向于相互融合成大脂质体，在融合过程中会丢失抗原。脂质体对抗原的包封率不均一，很难发挥疫苗的免疫作用。

2  油乳佐剂

油乳佐剂是指将一定比例的油相和水相通过乳化制备而成的混合物，其作用机理大致如下。首先，油乳佐剂对抗原进行包被，在抗原进入动物体内后，保护其不被体液中的各种酶迅速分解，通过缓慢释放抗原，延长刺激机体的时间；同时贮库效应可使特异性抗原持续刺激动物机体，从而产生特异性免疫应答，提高抗原的免疫原性。其次，油佐剂疫苗可引起注射部位细胞浸润，诱发动物机体局部产生炎症反应，诱使巨噬细胞、淋巴细胞等抗原呈递细胞聚集和增殖，从而增强细胞免疫应答和体液免疫应答。最后，在油乳佐剂的作用下，抗原可经淋巴管被运送至整个淋巴结和脾脏处，从而进一步产生新的刺激，诱导抗体生成。油乳佐剂还可通过刺激各种细胞因子如IL-2、IL-6等的分泌，在免疫反应中发挥作用。油乳佐剂最主要的成分是油料，根据油料的不同，分为矿物油佐剂和非矿物油佐剂两种。

2.1 矿物油佐剂

矿物油佐剂所用的油料通常称为柏油，主要成分是液体石蜡，以弗氏佐剂最为经典，分为弗氏不完全佐剂（Freund incomplete adjuvant，FIA）和弗氏完全佐剂（Freunds complete adjuvant，FCA）两种，虽能刺激动物机体产生很强的体液免疫和细胞免疫应答，但毒性大、稳定性差，难以长期保存，常常引起局部肉芽肿和无菌性脓肿，目前这两种佐剂已不用于疫苗的生产。白油佐剂，是一种液体类烃类的混合物，别名液体石蜡，是目前兽用疫苗佐剂使用最为广泛的佐剂，由石油经深度脱蜡、化学精制等工艺处理后获得，例如Specol剂、Montanide ISA50、Montanide ISA206、Montanide ISA15VG、IMS1315VG，由礦物油和乳化剂组成。与抗原乳化后，疫苗呈乳状液，注入动物机体，可持续缓慢释放，延缓抗原在体内的存留时间，增强巨噬细胞的杀菌和吞噬能力。

2.2 非矿物油佐剂

非矿物油佐剂的油料成分主要指角鲨烯、角鲨烷以及植物油等。与矿物油的不可代谢相反，非矿物油佐剂在动物体内可被代谢，副作用小。植物油佐剂主要有花生油，如佐剂65是在花生油和表面活性剂Arlacel A中加入硬脂酸铝制成的油包水型佐剂；角鲨烯和角鲨烷主要来自深海鲨鱼鱼肝，主要有MF-59、SAF等。

SAF系列佐剂由苏氨酰基胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP）、Tween-80以及非离子表面活性剂等组成，因此具有表面活性剂和双亲性的作用，能够有效地靶向呈递抗原到淋巴细胞，进而诱导动物机体产生各类细胞因子，提高体液免疫和细胞免疫应答，并且对动物和人都没有明显的副作用。最初，角鲨烯是分离于鲨鱼的肝脏，从植物中获取角鲨烯虽是一种可持续的替代方法，但产量低。随着合成生物学的进步，为药用级角鲨烯提供了创新生物合成方法，使角鲨烯生产更灵活、更便宜。

根据油乳剂疫苗的分散状态，可以将其分为油包水型（W/O）、水包油型（O/W）、水包油包水型（W/O/W）三种类型。W/O型油乳剂疫苗的乳状液黏度较高，可注射性差，但能在注射部位长时间贮存，缓释作用强，佐剂活性高，能长时间地为抗原提供免疫增强作用；O/W型油乳剂疫苗的乳状液黏度低，通针性强，安全性较高，接种后疫苗扩散快，抗体水平上升迅速，但佐剂活性低，不能产生长效机制；双相型（W/O/W）乳剂疫苗的黏度、通针性、在体内作用时间和活性的发挥均介于O/W型和W/O型之间。注射后疫苗吸收良好，接种部位的炎症反应小，同时既可激发体液免疫，也可诱导细胞免疫。

3  小结

由于各种复杂的病原微生物常常呈现混合感染，慢性病导致的动物机体出现免疫功能低下或免疫抑制，有效疫苗的研发面临着越来越严峻的挑战。根据佐剂的作用机制，在佐剂的优点和其产生的不利反应之间选取一个平衡点。正确地选择和应用佐剂可以充分发挥抗原的自身优势，有效地激发动物机体免疫系统，增强免疫应答，特别是对免疫力低下的动物意义重大。理想的兽用疫苗佐剂应具备的特征：安全性好，要确保免疫动物后产生的毒副作用小；良好的耐受性，可在动物机体内长时间存在，持久稳定地发挥佐剂作用；与抗原具有相容性，吸附抗原后可增加抗原的表面积，增强抗原的免疫原性，提高抗体产量；易于规模化生产，生产成本低；能有效地激发细胞和体液免疫应答；与抗原混合制成的疫苗成品在安全有效的前提下，应具备黏度较低、通针性强、颗粒粒径小、颗粒均一、稳定性良好等特点，可提高动物机体中的抗体水平，且无明显不良反应等。随着研究的深入，佐剂的应用范围也逐渐扩大，不再局限于增强疫苗的免疫应答，还包括增强动物机体对细菌、病毒、真菌、寄生虫的抵抗力。相信对佐剂的有效应用会在人类和动物的疾病预防等领域发挥更大的作用。