高效液相色谱-串联质谱法检测动物性食品中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺虫乙酯残留量

陈 盛

（上海必诺检测技术服务有限公司，上海 201114）

氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺虫乙酯均属于广谱类杀菌剂。氟吡菌胺，化学式为C14H8Cl3F3N2O，被广泛应用于水果、蔬菜等经济作物中卵菌门真菌引起的霜霉病、疫病、晚疫病、猝倒病等重要病害的防控[1]。氟吡菌酰胺，化学式为C16H11ClF6N2O，被广泛应用于农作物中霜霉病、菌核病和叶斑病等病害的防控[2]。螺虫乙酯化学式为C21H27NO5，可用于防治农作物、果树和蔬菜中的蚜虫、木虱和蚧科等刺吸式口器害虫[3]。该类型杀菌剂可通过污染土壤、水体等对畜禽养殖、人类生存环境及生命健康造成一定程度的影响。我国在最新实施的《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）[4]中明确动物性食品中这3种杀菌剂的最大残留限量为0.01 mg·kg-1。

目前，国内关于农产品中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺虫乙酯残留的检测方法主要为色谱法[5-6]、质谱法[7-10]、QuEChERS-结合质谱法[11-14]，尚无关于动物性食品中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺虫乙酯同时使用QuEChERS-结合质谱检测的方法。本次研究拟以乙腈为提取液，采用QuEChERS法净化样品，用超高效液相色谱-质谱联用法对氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺虫乙酯残留量进行测定，为日常开展相关检测、标准制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉，购自上海盒马生鲜超市；牛肉，购自上海盒马生鲜超市。

甲酸、乙酸铵、乙腈，色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；氯化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；氟吡菌胺标准物质（100.10±0.03）μg·mL-1，北京振翔科技有限公司；氟吡菌酰胺标准物质（1 000.5±3.0）μg·mL-1，北京振翔科技有限公司；螺虫乙酯（101.20±0.05）μg·mL-1，阿尔塔科技有限公司；CNW SPE 基质分散固相萃取纯化管，150 mg MgSO4，50 mg PSA，2 mL/100 pcs，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

电子分析天平：BP211D，德国Sartorius公司；高速冷冻离心机：Sovall ST16R，美国ThermoFisher公司；漩涡振荡器：Basic Vortex Mixer，美国Talboys公司；氮吹仪：DC-24，上海安谱实验科技股份有限公司；高速均质机：T18 digital ULTRA TURRAX，德国IKA公司；超高效液相色谱-质谱联用仪：Agilent 1290+6470，美国Agilent公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品提取及净化

准确称取粉碎均匀的肌肉组织样品10 g（精确到0.01 g）放入50 mL离心管，加入20 mL乙腈溶液，加入3～5 g无水硫酸钠于离心管中，使用高速均质机对样品均质1 min，后将离心管置于涡旋振荡器上继续剧烈振荡提取5 min，并离心10 min（4 ℃、8 000 r·min-1）。移取乙腈层至另一离心管中，加入10 mL乙腈饱和的正己烷，于涡旋振荡器上继续剧烈振荡后，以8 000 r·min-1速率离心5 min，弃去正己烷，乙腈层待净化。

吸取10 mL乙腈转移至SPE基质分散固相萃取纯化管中，涡旋混匀3 min，以8 000 r·min-1速率离心5 min。吸取上清液至试管中，在50 ℃条件下，氮吹吹至近干，用1∶1乙腈水溶液定容，过0.22 μm滤膜过滤，待上质谱分析。

1.3.2 仪器条件

（1）液相色谱条件。色谱柱：Infinitylab Poroshell 120 EC-C18（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）。流动相A：0.1%甲酸水溶液（含10 mmol乙酸铵）；流动相B：乙腈。液相流动相梯度洗脱程序见表1。流动相流速0.3 mL·min-1；柱温箱温度40 ℃。

表1 液相流动相梯度洗脱程序

（2）质谱条件。电离方式：电喷雾正离子源（ESI+）；离子源温度：150 ℃；电喷雾电压：1.3 kV；毛细管电压：4 kV；正离子扫描及多反应监测（MRM）；干燥气温度：350 ℃，干燥气流量：10 L·min-1；加热气流量：10 L·min-1；脱溶剂气温度：350 ℃；雾化气压力：40 psi。直接进样氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺虫乙酯标准溶液进行全扫描，获得3种农药的母离子分别为m/z383.0、397.1及374.1，后进一步进行离子扫描，分别得到定性离子及定量离子，通过质谱条件优化，得到最佳检测灵敏度，最终结果具体数值详见表2。

表2 氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺虫乙酯的多反应监测质谱参数

1.3.3 溶液配制

标准贮备液：分别准确称取氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺虫乙酯农药标准品，用甲醇定容，得到浓度为100 μg·mL-1标准贮备液，保存于-18 ℃冰箱备用。

混合标准中间溶液（1 μg·mL-1）：分别用移液管准确吸取0.50 mL氟吡菌胺、氟唑菌酰胺、螺虫乙酯标准贮备液于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。保存于4 ℃冰箱，有效期为7 d。

基质混合标准工作溶液：分别准确称取7份不含3种待测农药的空白实验样品于50 mL离心管中，经样品前处理后，用得到的空白基质溶液配制成不同浓度的混合标准溶液，浓度均分别为2 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1和200 μg·L-1。

2 结果与分析

2.1 样品提取溶剂的选择

本实验选取甲醇和乙腈作为提取试剂，氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺虫乙酯均可溶于上述2种有机试剂。通过在空白基质中添加氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺虫乙酯农药标准品，并使用这2种试剂进行提取，考察其样品回收率。结果显示，乙腈提取回收率为95%，甲醇提取回收率为92%。这2种试剂均能达到农药残留分析的要求，实现3种农药的有效提取。其中，乙腈可以起到沉淀样品中蛋白质的作用，且从样品中提取出的色素、脂肪较少，综合考虑提取效果及回收率，选择乙腈作为提取试剂。

2.2 净化方式的选择

净化是样品前处理中的关键环节，选取合适的净化方式能够有效去除基质中的杂质，缩短净化时间，有效富集被测物，大大提高检测灵敏度。在检测动物源性样品中的农药残留时，提取液中的脂肪、蛋白质、色素等杂质可能会给质谱检测结果带来很大的基质干扰，从而影响检测结果的灵敏度及准确度。

本次分别使用固相萃取法和QuEChERS法进行实验后，发现两种方法均能满足这3种农药的检测需求，其中固相萃取法回收率为82%，QuEChERS法回收率为85%。但QuEChERS法具有节省实验时间、消耗有机试剂少、操作简单的优势，故选用QuEChERS法作为本实验的净化方法。

2.3 线性关系与检出限

称取适量的氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺虫乙酯标准品，配制浓度范围在2～200 μg·L-1的系列基质混合标准工作溶液，在优化实验条件下进行测定，以质量浓度（X，mg·L-1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，结果如表3所示，相关系数均＞0.992，检出限为0.01 mg·kg-1，定量限为0.03 mg·kg-1。

表3 线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.4 准确度及精密度实验

采用加标法，选取猪肉、牛肉阴性样品，分别添加0.03 mg·kg-1、0.10 mg·kg-1、0.30 mg·kg-1及0.50 mg·kg-1标准混合溶液进行回收率实验，每个添加水平重复测定6次，测定后得到氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺虫乙酯在两种不同肉类基质中的平均回收率为80.3%～94.3%，相对标准偏差（RSD）为4.3%～8.7%。由表4可知，该方法的准确度及精密度符合农药残留分析检测的要求。

表4 氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺虫乙酯回收率及相对标准偏差测定结果

3 结论

本实验研究了LC-MS/MS同时测定猪肉、牛肉基质中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺虫乙酯残留量的方法。通过优化实验条件，采用QuEChERS法净化，以0.1%甲酸水溶液（含10 mmol乙酸铵）及乙腈为流动相进行梯度洗脱，通过Poroshell 120 EC-C18液相柱分离，以电喷雾正离子（ESI+）多反应监测模式对目标物进行定性定量分析。该方法添加回收率在80.3%～94.3%，标准偏差（RSD）在4.3%～8.7%。实验证明该法在提高检测效率、目标物分离效果、精准分析方面具有优势，完全可以满足同时测定动物性食品中氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、螺虫乙酯残留量的需求。同时，也可为在鱼、虾、蟹、鸡肉等类似基质样品中的方法研究提供参考依据。