螺虫乙酯及其代谢产物在猕猴桃中的残留消解动态

黄玉南，乔成奎，庞涛，罗静，庞荣丽，郭琳琳，李君，王瑞萍，谢汉忠

（1.中国农业科学院郑州果树研究所，农业部果品质量安全风险评估实验室（郑州），河南郑州 450009）（2.中检溯源江苏技术服务有限公司，江苏南京 211215）

螺虫乙酯（Spirotetramat）是2008年由拜耳作物科学公司开发的一种新型季酮酸衍生物类杀虫剂，是迄今发现的唯一双向内吸性广谱杀虫剂[1]，通过抑制昆虫脂质的合成，使昆虫中毒死亡[1,2]。螺虫乙酯为低毒性杀虫剂，在土壤中易降解，可有效防治木虱、粉虱、介壳虫、棉盲蝽等害虫，且持效期长，可提供长达8周的有效防治[3～6]。螺虫乙酯一旦进入植物体内被代谢 4种主要代谢产物，主要有螺虫乙酯烯醇（B-enol）、螺虫乙酯羟基（B-mono）、螺虫乙酯醇酮（B-keto）和螺虫乙酯烯醇糖苷（B-glu）[7]。文献研究结果表明从螺虫乙酯代谢物的生物活性研究来看，螺虫乙酯烯醇的活性在4个代谢物中表现最好，是螺虫乙酯在生物体内起主要作用的活性分子。代谢后产生的螺虫乙酯烯醇是一种弱酸，由于这种弱酸有着较小的油水分配系数[8]，使得它可以由木质部和韧皮部，甚至对隐匿的害虫及新出的牙叶进行有效的预防保护[6]。

图1 螺虫乙酯及其4种代谢物的结构式Fig.1 Structural formulas of spirotetramat and its four metabolites

目前，国内关于螺虫乙酯降解的研究已有报道，主要关注螺虫乙酯本体的变化规律，如杜芳[9]、王珏[10]、吴育佳[11]、吴文铸[12]等分别做了螺虫乙酯在大豆、番茄、黄瓜、柑橘和土壤中降解研究。但是对螺虫乙酯代谢产物的研究较少，Li[13]、Biju[14]和 Chahil[15]研究了螺虫乙酯和3种代谢产物B-keto、B-glu、B-enol在辣椒中的变化规律，Chen Xiaojun[16]等研究了4种物质在菠菜分布规律及代谢残留水平。对于螺虫乙酯及代谢产物在猕猴桃上的代谢均没有研究。本研究通过采用QuEChERS及固相萃取法，建立了猕猴桃中螺虫乙酯及4种代谢产物的LC-MSMS检测方法，对螺虫乙酯及代谢产物在桃上的消解动态和残留规律进行实验研究，研究结果为该农药使用后果品的安全性评价，制定猕猴桃上的合理使用浓度、保障果品安全提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1290-6460 超高效液相串联质谱仪，美国Agilent公司；Oasis MAX固相萃取柱（150 mg/6 mL），美国waters公司；台式高速冷冻离心机（H2050R），湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；氮气吹干仪（BF2000），北京八方世纪科技有限公司；电热板（EH20B），美国莱伯泰科仪器公司。

螺虫乙酯（Spirotetramat）、螺虫乙酯烯醇（B-enol）、螺虫乙酯羟基（B-mono）、螺虫乙酯醇酮（B-keto）、螺虫乙酯烯醇糖苷（B-glu）标准品，均购自德国Dr.E公司；PSA，北京艾杰尔科技有限公司；乙腈、甲醇（均为HPLC级），购自美国Fisher公司；乙酸（分析纯），莱阳市双双化工有限公司；甲酸（HPLC级），德国CNW公司；氨水（分析纯），开封开化（集团）有限公司，实验用水为屈臣氏蒸馏水。

施药药剂：22.4%螺虫乙酯悬浮剂，拜耳股份公司（推荐在苹果上的使用剂量3000倍～4000倍稀释液，安全间隔期为21 d）。

1.2 田间试验

1.2.1 猕猴桃消解动态试验

以螺虫乙酯试验药剂，以猕猴桃为试验对象，以推荐高剂量的1.5倍（2000倍液）为施药浓度，在施药后0（2 h）、1、2、3、5、7、9、16、23、30、37 d采集样品，研究施药后螺虫乙酯及其降解产物在猕猴桃中的降解变化规律。

1.2.2 土壤消解动态试验

选一块30 m2样地，单独施药，施药浓度为2000倍稀释液。设置3个重复小区。喷雾后分别于0（2 h）、1、2、5、7、9、16、23、30、37 d随机取点5～10个，采用土钻采集0～15 cm深度土壤1～2 kg，除去土壤中的碎石、杂草和植物根茎等杂物，过40目筛后保存于-20 ℃待测。

1.2.3 最终残留试验

最终残留试验施药浓度为最高推荐使用量的常量组（3000倍液）和高量组（2000倍液），喷雾量为3000 L/hm2。于果实长到一半大小时开始第1次施药，各施药2和3次，每个处理设3个重复小区，每个小区2株猕猴桃树，施药间隔为10 d，处理间设保护带。猕猴桃样本的采样时间为距离最后1次施药后的7、14和21 d。

1.3 样品前处理

准确称取样品10.0 g（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋10 min，加入3～4 g NaCl（140 ℃，烘烤4 h），涡旋1 min，在5000 r/min下离心5 min；取上清液1.5 mL，加入30 mg PSA和50 mg无水硫酸镁，振荡1 min，10000 r/min下离心5 min；取上清液过0.22 μm有机滤膜，待测。

1.4 检测条件

色谱条件：Agilent-Pcroshell 120 EC-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm），柱温35 ℃；A 为含0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0～8 min、30%～90% B，8～9 min、90%～30% B，9～10 min、30%B；流速0.3 mL/min；进样量5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；扫描模式：正离子模式；检测方式：多反应监测（MRM）；干燥气温度 350 ℃；干燥气流速 8 L/min；鞘流气温度350 ℃，流速12 L/min；毛细管电压：4000 V。

表1 螺虫乙酯及4种代谢产物的质谱条件Table 1 Mass spectra of spirotetramat and its four metabolites

1.5 标准溶液的配置及基质标准曲线绘制

分别准确称取0.0100 g（精确至0.0001 g）螺虫乙酯和 4种代谢产物标准品，用乙腈溶解并定容至100.00 mL，分别配制成100 mg/L的标准品储备液，于-20 ℃下避光保存。分别移取各标准储备液2.5 mL至10 mL容量瓶中，用乙腈定容，配成25.00 mg/L标准工作液，即用即配。

用空白猕猴桃和土壤样品的提取液稀释标准工作液，用乙腈稀释，配置成系列浓度的螺虫乙酯和4种代谢产物的混合基质标准溶液，其中螺虫乙酯和B-enol的质量浓度为0.005、0.01、0.05、0.10、0.50、1.0、2.0 mg/kg，B-glu、B-keto和B-mono的质量浓度为0.005、0.01、0.05、0.10、0.50 mg/kg。按1.4节条件进行检测。分别以标准物质的质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.6 添加回收实验

分别向空白猕猴桃和土壤样品中添加4个水平的螺虫乙酯及其4种代谢产物的混合标准溶液，添加水平分别为0.05、1.0和2.0 mg/kg。按1.3节方法进行前处理，按1.4节条件检测，计算添加回收率及相对标准偏差（RSD）。

1.7 数据统计分析

实验数据处理及作图采用 Sigma Plot 12.0和Excel 2016处理分析。

2 结果与分析

2.1 方法的线性范围、准确度及精密度

从表2可知，在0.01、0.5和2.0 mg/kg的添加水平下，螺虫乙酯和B-enol在猕猴桃和土壤中的回收率为75.49%～105.54%，相对标准偏差为1.96%～7.91%；在0.01、0.05、0.10 mg/kg的添加水平下，B-glu、B-keto和 B-mono在猕猴桃和土壤中的回收率为73.97%～110.52%，相对标准偏差为2.32%～7.65%。结果符合农药残留检测要求。

表2 螺虫乙酯及代谢产物在猕猴桃和土壤中的添加回收率及相对标准偏差Table 2 Average recoveries and relative standard deviation (RSD) for spirotetramat and its metabolites in kiwifruit and soil (n=6)

2.2 螺虫乙酯及代谢产物在猕猴桃果实上的消解动态

表3 螺虫乙酯和B-enol在猕猴桃中的消解动态Table 3 Dissipation dynamics of spirotetramat and B-enol in kiwifruit

图2 螺虫乙酯和B-enol在猕猴桃中的动态变化Fig.2 Dynamic curve of spirotetramat and B-enol residue in kiwifriuts

图3 B-mono和B-keto在猕猴桃中的动态变化Fig.3 Dynamic curve of B-mono and B-keto residue in kiwifruits

螺虫乙酯在施药2 h内降解为B-enol、B-keto。之后随着时间的延长，螺虫乙酯、B-enol的含量呈降低趋势，而 B-keto的含量呈增高趋势；在施药后 16 d后代谢产生B-mono，含量为0.001 mg/kg，在随后的16 d到37 d的时间里，B-mono在猕猴桃中的含量呈逐渐增高的状态。螺虫乙酯的代谢产物B-glu几乎未检出。

施药后2 h，螺虫乙酯、B-enol的原始沉积量分别为0.54 mg/kg、1.71 mg/kg。以施药后时间、残留量绘制螺虫乙酯、B-enol在猕猴桃果实上的残留消解动态曲线。消解动态符合一级动力学模型，消解方程分别为ct=0.562e-0.170x（r=0.836）和ct=1.689e-0.108x（r=0.584），消解半衰期分别为4.08 d和6.39 d。施药后螺虫乙酯、B-enol 23 d转化率分别为78.38%和62.35%。

2.3 螺虫乙酯及代谢产物在土中的消解动态

图4 螺虫乙酯、B-enol和B-keto在土壤中的消解动态Fig.4 Dynamic curve of spirotetramat, B-enol and B-keto residue in soils

在螺虫乙酯施入土壤后的 2 h内，迅速降解为B-enol和B-keto。螺虫乙酯、B-enol和B-keto的原始沉积量分别为0.40 mg/kg、1.53 mg/kg、0.28 mg/kg，之后随着时间的延长螺虫乙酯、B-enol和B-keto的含量逐渐降低。以施药后时间、残留量绘制螺虫乙酯、B-enol和B-keto在土中的残留消解动态曲线。消解动态符合一级动力学模型，消解方程分别为ct=0.285e-0.487x、ct=2.275e-0.348x、ct=0.408e-0.323x，半衰期分别为1.42 d、1.99 d和2.14d。施药23 d后螺虫乙酯、B-enol和B-keto的转化率分别为98.48%、91.34%和92.13%。而螺虫乙酯的代谢产物B-mono和B-glu在样品中均没有检出。

表4 螺虫乙酯、B-enol和B-keto在土壤中的消解动态Table 4 Dissipation dynamics of spirotetramat, B-enol and B-keto in soils

2.4 螺虫乙酯及代谢产物在猕猴桃中的最终残留

螺虫乙酯分别按照2000倍和3000倍稀释液喷施2次和3次，距末次施药后7 d、14 d、21 d和28 d采样测定，螺虫乙酯在猕猴桃中的含量为 0.06～0.52 mg/kg。

猕猴桃中 B-enol的含量为 0.58～3.44 mg/kg，B-mono的含量为 0～0.02 mg/kg，B-keto的含量为0.09～0.35 mg/kg，B-glu在样品中没有检出。

2.5 螺虫乙酯及代谢产物在土中的最终残留

螺虫乙酯分别按照有效成分2000倍和3000倍剂量喷施2～3次，距末次施药后7 d、14 d和28 d采样测定，样品中没有螺虫乙酯、B-mono、B-glu检出，B-enol的含量为0～0.04 mg/kg，B-keto的含量为0～0.04 mg/kg。

表5 螺虫乙酯及4种代谢产物在猕猴桃中的最终残留量Table 5 The final residues of spirotetramat and its four metabolites in kiwifruits

表6 B-enol和B-keto在土壤中的最终残留量Table 6 The final residues of B-enol and B-keto

3 结论

3.1 本文建立了螺虫乙酯及其代谢产物在猕猴桃和土壤中的残留检测方法，准确度和精密度较好，方法简单便捷，能满足对目标物的快速检测需求。

3.2 本研究测得螺虫乙酯被施用到猕猴桃和土壤中后迅速降解为B-enol、B-keto，在猕猴桃中螺虫乙酯、B-enol呈逐渐降低的趋势，而B-keto和B-mono呈逐渐升高的趋势；在土壤中螺虫乙酯、B-enol、B-keto均呈逐渐降低趋势，B-mono和B-glu在样品中均没有检出。螺虫乙酯和B-enol在土壤中的降解速度（1.42 d、1.99 d）快于在猕猴桃上的降解速度（4.08 d和6.39 d）。

3.3 目前螺虫乙酯在苹果树、梨树、柑橘树和番茄上进行了登记，在在猕猴桃上没有进行登记。推荐在苹果树上的施药方式为3000～4000倍液喷施，在梨树和柑橘树上的推荐剂量为4000～5000倍液，安全间隔期分别为21 d、21 d和20 d；最多施用次数均为2次。本实验以3000倍液稀释液喷施2次，28 d后，猕猴桃中螺虫乙酯母体的残留量为0.06 mg/kg，远高于我国制定的0.02 mg/kg的最大残留限量值。因此螺虫乙酯在猕猴桃中施用合适剂量还有待进一步研究。