固相萃取-高效液相色谱法测定豆豉制品中苯甲酸钠和山梨酸钾含量

单晓静

（广东美味鲜调味食品有限公司，广东中山 528437）

豆豉制品营养丰富，富含优质蛋白质、不饱和脂肪酸等营养物质，受到众多消费者的青睐[1]。但豆豉制品容易因微生物污染而腐败变质，不容易保存[2]，不少厂家为了延长豆豉制品的货架期，会选择违规过量添加苯甲酸钠、山梨酸钾等防腐剂。

目前检测调味品中山梨酸钾和苯甲酸钠的方法主要有液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[3]、气相色谱法（Gas Chromatography，GC）[4]、液质联用法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）[5]。研究对象主要集中在酱油、醋等调味品，很少有涉及豆豉制品防腐剂检测的方法研究。豆豉基体比较复杂，其中含有大量的色素、蛋白质、油脂等成分，直接对目标成分进行测定时存在较大干扰，会对仪器造成较大损耗，易损坏色谱柱。本文采用固相萃取小柱（Solid Phase Extraction，SPE）技术对豆豉样品进行预处理，实验结果表明，本方法与传统方法相比，准确度高，重复性好，样品基体无杂质干扰，适用于市面上的豆豉样品苯甲酸钠和山梨酸钾含量检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆豉制品：市售。

甲醇、乙腈、异丙醇（HPLC级，Merck）；苯甲酸钾、山梨酸钠标准品（aladdin）；HC-C18固相萃取小柱（CNW，10 mL，填料2 g）；其余试剂均为分析纯；实验用水为一级水。

Agilent 1200型高效液相色谱仪：美国安捷伦公司（配置自动进样器、二极管阵列检测器）；超声发生器；CNW 12位固相萃取真空装置。

1.2 色谱条件

色谱柱：Phenomenon Luna Cl8柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：230 nm；流动相：甲醇∶乙酸铵溶液（20 mmol·L-1）=5∶95。

1.3 样品处理

将豆豉样品用搅拌器打碎，称取2 g打碎后豆豉样品于50 mL塑料具塞离心管中。加10%甲醇水溶液约20 mL，涡旋混匀5 min，将超声仪温度调至50 ℃，并将样品置于超声仪中超声20 min，样品取出放凉后分别加2 mL乙酸锌和亚铁氰化钾溶液，用漩涡振荡器混匀后6 000 r·min-1离心10 min。转移水相层至50 mL玻璃容量瓶中，于残渣中加10%甲醇水溶液20 mL，重复上述超声和离心操作，将水相层转移到同一50 mL玻璃容量瓶中。用0.01 mol·L-1盐酸溶液将样品溶液pH调节至4.0并定容至容量瓶刻度，混匀。将5 mL样品溶液上样到已活化的SPE固相萃取小柱，分别用5 mL水和5 mL 10%甲醇水溶液淋洗，然后用5 mL甲醇溶液洗脱目标物并将洗脱液接收到10.0 mL容量瓶，定容至刻度，混匀，待色谱分析。

1.4 标准溶液配制

精确称取一定量的山梨酸钾、苯甲酸钠对照品，用甲醇稀释配制混合标准系列工作液，浓度为1 mg·L-1、5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1和50 mg·L-1。

1.5 结果定性定量

以目标物标准品的保留时间进行定性，外标法进行定量。以峰面积为纵坐标，溶液浓度为横坐标在仪器工作站上作校正曲线，相关系数要求R2≥0.995，通过仪器工作站自动从校正曲线上读取目标物浓度。

2 结果与分析

2.1 萃取剂的选择

重点对比了用纯水、10%甲醇水溶液、20%甲醇水溶液作为苯甲酸钠和山梨酸钾提取剂，发现用纯水作为萃取剂，因豆豉中油脂含量较高，容易造成乳化，而且提取率不好，回收率低，而加入10%甲醇的水溶液能克服上述两点不足，萃取率达到100%。20%甲醇水溶液因为有机相比例较高，在样品溶液上样固相萃取小柱时会造成目标物的部分洗脱，造成回收率偏低，故本文使用10%甲醇水溶液作为萃取溶剂。

2.2 固相萃取小柱方法条件优化

由于苯甲酸、山梨酸极性较弱，C18固相萃取柱对上述两种物质的保留能力较强，样品上柱后用少量水和10%甲醇水溶液淋洗柱子，去除部分杂质，再用高比例有机相洗脱目标物，可获得较好的回收率，纯化效果较好。本文采用甲醇、乙腈和异丙醇3种溶剂对目标物进行洗脱，考察其对目标物的洗脱效果。实验结果表明，甲醇和乙腈的洗脱能力接近，目标物回收率较高，而异丙醇洗脱能力较差，回收率偏低。因此，本文选择甲醇作为洗脱液，目标化合物被萃取柱吸附后，分别用5 mL水和5 mL 10%甲醇淋洗净化，用甲醇洗脱目标化合物，上液相色谱分析后，得到的色谱图如图1所示。

图1 豆豉加标样品经净化后在230 nm检测波长下的苯甲酸（1）、山梨酸（2）的色谱图

2.3 样液pH对回收率的影响

实验中发现样液的pH会影响目标物在固相萃取小柱上的吸附，从而对方法回收率造成影响。将样液pH调节成2.0、4.0、6.0、8.0共4个梯度，将4个梯度样液分别进行上柱，按上述样品处理方法进行预处理，上机测定，计算相关组分的回收率，结果见表1。

表1 不同pH梯度样液回收率

由表1可知，当样液pH≤4.0时，方法回收率在99.8%～101.3%，说明低pH能有效抑制苯甲酸钠和山梨酸钾的解离，使其在固相萃取柱上吸附牢固。当样液pH＞4.0，目标物在水溶液中逐渐解离，不能很好地吸附在固相萃取柱上，造成回收率降低。

2.4 标准曲线线性范围、回归方程、方法检测限及定量限

配制1～50 mg·L-1系列浓度梯度的标准工作液上机测定，回归方程及相关系数R2见表2。进空白样，以3倍信噪比对应目标物含量为检出限，10倍信噪比对应目标物含量为定量下限，确定苯甲酸钠、山梨酸钾在豆豉制品中的方法检出限及定量限如表2所示。

表2 山梨酸钾、苯甲酸钠的回归方程、相关系数、检出限和定量限

2.5 回收率与精密度

取空白样品，每份2 g，共3组，分别定量加入苯甲酸钠、山梨酸钾标准物质溶液，加标浓度为400 mg·kg-1。按上述样品处理方法进行预处理，上机测定，分别计算其回收率和精密度，回收率及精密度数据见表3。由表3可知，苯甲酸钠、山梨酸钾加标浓度为400 mg·kg-1时，苯甲酸钠、山梨酸钾加标回收率在98.7%～101.3%，相对标准偏差在0.81%～0.96%，方法回收率、精密度均符合方法学验证中回收率在90%～107%、CV≤4.31%的要求，说明方法准确性高，重复性好。

表3 山梨酸钾、苯甲酸钠加标回收率及精密度

3 结论

采用固相萃取-高效液相色谱法对豆豉制品中苯甲酸钠和山梨酸钾含量进行了分析，在1～50 mg·L-1线性关系良好，加标回收率在98.7%～101.3%，相对标准偏差在0.81%～0.96%，满足方法学验证的要求。本方法准确度高，重复性好，样品基体无杂质干扰，适用于市面上豆豉样品中苯甲酸钠和山梨酸钾含量的检测。