不同种群罗氏沼虾幼体的肠道菌群结构与功能特征分析

施金谷,武 霞,黄光华,杨慧赞,梁 怡,吕 敏,曾 兰,胡大胜,黄立斌,王 瑞

( 1.广西水产科学研究院,广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西 南宁 530021; 2.广西水产技术推广站,广西 南宁 530022; 3.广西师范大学 生命科学学院,广西 桂林 541006 )

罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii),又称金钱虾、马来大虾或长脚大虾,属节肢动物门甲壳纲十足目长臂虾科沼虾属[1],是世界上个体最大的淡水虾。罗氏沼虾肉质鲜嫩,具有食性杂、养殖周期短、生长快、病害少等特点,是一种优良的淡水养殖品种。近年来,罗氏沼虾养殖业发展迅猛,但在养殖过程中,溶解氧、温度、饲料等均可影响罗氏沼虾的免疫机能[2-3],免疫机能的下降会引起虾的疾病和死亡,从而影响上市虾的产量和规格,影响养殖户的收益。研究表明,在基础饲料中添加益生菌能显著增强肠道免疫机能[4-6]以及肠道内优势菌群的生长[7-8],提升机体的抗病能力[2,9-10]。肠道菌群失调会引起全身性的炎症,健康的肠道菌群由固定的菌群组成[11-12]。所以,肠道菌群的结构和丰度影响着宿主的生长与健康。

肠道微生物群是生活在动物肠道部位的生物集合,细菌是肠道中的主要定殖者,其他为真菌、古生菌、原生动物、真核寄生生物以及病毒等[13]。在长期的进化中,肠道微生物除了可以引起疾病的暴发,还可以与宿主互利共生,对宿主的营养代谢、吸收和生长等产生重要影响[14]。肠道微生物群结构的分析研究方法主要有传统纯培养法、ERIC-PCR分子杂交技术、基于16S rRNA的分子技术、荧光原位杂交技术以及宏基因组学研究方法等[15]。近几年,16S rRNA高通量测序是分析肠道微生物的主要技术,可以准确定位到分类学属水平。韩娜等[16]研究出一种新的定量16S rRNA基因扩增子测序方法,采用随机标签和内参法相结合,能降低试验因素的影响,有效提高肠道微生物群结构检测的精准性。16S rRNA测序技术已应用到畜牧学[17-19]、医学[20-21]、农学[22]和水产学[23-25]等多种学科专业。基于16S rRNA技术,邓祥宜等[26]研究了克氏原螯虾(Procambarusclarkia)的肠道菌群多样性,表明核心菌群在消化利用肠道中的蛋白质上起重要作用。目前,国内学者主要研究报道了凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[27-28]、克氏原螯虾[13,29]、日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)[30]等虾类的肠道菌群结构与特征,而关于罗氏沼虾的肠道菌群研究报道较少,主要集中在饲料中添加微生态制剂[2]、发酵豆粕[31]等对罗氏沼虾肠道菌群的影响及不同养殖条件对罗氏沼虾肠道菌群的影响[32]方面。笔者利用16S rRNA高通量测序技术,探究罗氏沼虾的肠道菌群结构与功能,分析不同种群罗氏沼虾幼体间的肠道菌群差异,以丰富和扩展罗氏沼虾肠道菌群的基础研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用缅甸种群、斯里兰卡种群、越南种群、孟加拉种群和自有品种1种群等5个不同种群的罗氏沼虾幼体,试验材料采自广西南宁国家级罗氏沼虾良种场。育苗用水为浓缩海水加入淡水配制,盐度10～12,水温28～29 ℃,pH 7.5～8.0,溶解氧质量浓度≥5 mg/L。早晚各投喂卤虫(Artemia)无节幼体1次,中间投喂蒸蛋微粒2次。所有样品为同一批孵化且孵化20 d的幼虾。

1.2 研究方法

1.2.1 样本采集

从育苗车间采集孵化20 d的5个不同种群的罗氏沼虾幼体,每个种群的幼体样本各2份,每份含罗氏沼虾幼体约3 g。样品采集后用无菌水冲洗5次,使用15 mL离心管存放,-80 ℃保存备用。

1.2.2 细菌的16S rRNA基因V3～V4区测序

于-80 ℃取出罗氏沼虾幼体样品,冰上融化后,按照HiPure Stool DNA Kit说明书方法提取肠道微生物的总DNA。采用PCR扩增细菌16S rRNA V3和V4区,扩增引物为341F(CCTACGG GNGGCWGCAG)和806R(GGACTACHVGGGT ATCTAAT)。反应体系(50 μL)为:10×Buffer KOD 5 μL、2 mmol/L dNTPs 5 μL、25 mmol/L MgSO43 μL、正向引物 (10 μmol/L) 和反向引物 (10 μmol/L)各1.5 μL、KOD 聚合酶 1 μL、模板 DNA 100 ng、超纯水补至50 μL。PCR扩增程序为: 94 ℃ 预变性2 min,98 ℃ 变性10 s,62 ℃ 退火30 s,68 ℃ 延伸30 s,30个循环;68 ℃终延伸 5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后,使用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒按照说明书方法进行回收,采用ABI StepOnePlus 实时PCR系统进行定量后在Illumina平台进行PE250测序,测序工作由广州基迪奥生物科技有限公司完成。

1.2.3 生物信息学分析

对罗氏沼虾幼体肠道菌群16S rRNA高通量测序数据进行生物信息学分析,主要分析步骤包括:(1)原始测序序列的拼接和质控:使用FASTP软件过滤低质量Reads,然后利用FLASH将双端Reads拼接为Tags,再过滤低质量的Tags,最后使用Usearch软件的UPARSE算法对运算分类单元进行聚类分析,相似度大于97%的序列聚为一类,计算每个运算分类单元在各个样品中的Tags绝对丰度和相对信息。(2)采用RDP Classifier的Naïve Bayesian assignment算法,与GreenGene 数据库(设定置信度的阈值为0.8～1.0)对代表性运算分类单元进行物种注释;计算Alpha多样性;在生物学分类的门水平和科水平进行细微生物群落结构和相对丰度分析,绘制群落Circro图和堆叠图,根据物种、样本间丰度相似性进行聚类,分析样本细微生物群落门、科水平组成的相似情况以及主要差异。(3)根据运算分类单元的物种注释和丰度信息,使用PICRUSt软件进行微生物群KEGG通路功能注释。(4)使用SPSS 26.0、WPS软件进行相关数据图形化处理。

2 结 果

2.1 运算分类单元分析

肠道菌群通过16S rRNA高通量测序及处理,5组样品共获得有效序列966 423条,按97%的相似度共划分出8185个运算分类单元。缅甸种群、斯里兰卡种群、越南种群、孟加拉种群和自有品种1种群罗氏沼虾组共有的运算分类单元为256个,每组独有的运算分类单元分别为131、247、231、144、184个(图1)。样本运算分类单元数量依次为越南种群>孟加拉种群>缅甸种群>斯里兰卡种群>自有品种1种群(图2),这说明5个种群的罗氏沼虾样品均含有较丰富的菌群种类,且核心菌群较相似。

图1 运算分类单元韦恩图Fig.1 Veen diagrams of OTUs

图2 各组运算分类单元数量Fig.2 Column diagram of OTUs in different groups

2.2 Alpha多样性分析

5组罗氏沼虾幼体肠道菌群的Alpha多样性指数见表1。组间平均覆盖率为99.67%～99.72%,表明试验所测数据能够真实反映样品中菌群的组成,测序深度已经基本覆盖到样本中所有的物种,存在新物种的可能性很小。孟加拉种的Chao指数和Ace指数均高于其他4组,表明孟加拉种群幼虾的肠道菌群物种丰富度最高。各组样品的香农指数依次为越南种群>斯里兰卡种群>缅甸种群>孟加拉种群>自有品种1种群,表明罗氏沼虾越南种群幼虾的肠道菌群多样性最高,与运算分类单元的检测结果相符。各组样品的辛普森指数依次为斯里兰卡种群>越南种群>缅甸种群>孟加拉种群>自有品种1种群,表明罗氏沼虾斯里兰卡种群幼虾的肠道菌群种数最多,且各种个体分配更均匀,物种多样性程度高。

表1 各组样品的Alpha多样性指数Tab.1 Alpha-diversity index of the samples in different groups

2.3 肠道菌群整体结构分析

2.3.1 肠道菌群在门水平上的结构分析

在生物分类学门水平上,5组样品的肠道菌群共注释到13个门,平均相对丰度大于1%的门有5个,分别为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、蓝藻菌门和浮霉菌门。缅甸种群、越南种群、孟加拉种群和自有品种1种群的平均相对丰度排名前3的菌门一致,由大到小依次为变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门,只有细菌丰度比例存在一定的差异:缅甸种群为64.43%、32.89%和1.94%;越南种群为77.34%、18.64%和1.80%;孟加拉种群为68.15%、28.56%和1.76%;自有品种1种群的为84.73%、12.65%和0.66%。这4个组的绝对优势菌门均为变形菌门和拟杆菌门。而斯里兰卡种群中厚壁菌门的丰度相对较高,其优势菌门依次为变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门,占比分别为85.32%、7.97%和4.46%(图3)。

图3 各组样品门水平上的菌群群落Circos图Fig.3 Circro diagram of microbial community on phylum level in different groups

2.3.2 肠道菌群在科水平上的结构分析

在生物分类学科水平上,罗氏沼虾不同种群幼虾的肠道菌群结构分析见图4。各组样品检测到的绝对优势菌科均为肠杆菌科,其他优势菌科(相对丰度大于1%且排名前4)在各组样品的分布具有明显差异。缅甸种群以肠杆菌科(51.05%)、螺旋体科(23.77%)、黄杆菌科(10.42%)和Stappiaceae(7.38%)为优势菌科;斯里兰卡种群以肠杆菌科(60.07%)、弧菌科(21.53%)、烟杆菌科(97.23%)和希瓦氏菌科(4.9%)为优势菌科;越南种群以肠杆菌科(48.31%)、黄杆菌科(15.49%)、弧菌科(10.5%)和Cellvibrionaceae(7.41%)为优势菌科;孟加拉种群以肠杆菌科(59.37%)、黄杆菌科(26%)、螺旋体科(4.11%)和希瓦氏菌科(3.68%)为优势菌科;自有品种1种群以肠杆菌科(81.31%)、黄杆菌科(6.01%)、Stappiaceae(4.16%)和螺旋体科(3.8%)为优势菌科。

图4 各组样品科水平上的菌群群落结构及相对丰度Fig.4 The community structure and relative abundance on family level in different groups

2.4 细菌群落功能预测

PICRUSt分析表明,罗氏沼虾肠道菌群所预测到的功能基因可注释到KEGG数据库中6条1级通路以及33条2级通路(平均相对丰度>1%)。1级通路结果表明,基因主要富集在新陈代谢、遗传信息处理、细胞进程、环境信息处理、生物系统、人类疾病通路中。在5个组中,新陈代谢类通路富集的功能基因均占所有通路富集到的功能基因的约80%(图5),表明罗氏沼虾幼虾肠道菌群的主要功能是参与肠道内各种物质的消化与代谢。2级通路结果表明,基因主要富集在新陈代谢通路中的碳水化合物代谢、氨基酸代谢、维生素代谢、萜类和聚酮类化合物代谢、其他氨基酸代谢、脂质代谢、外源生物降解和代谢、能量代谢和糖基生物合成与代谢等,遗传信息处理类通路中的复制与修复、折叠、分类和降解,细胞进程类通路中的细胞运动,以及环境信息处理类通路中的膜转运。

图5 各组样品1级通路功能占比Fig.5 Functional proportion of primary pathway in different groups

3 讨 论

3.1 罗氏沼虾幼体肠道菌群结构特征分析

罗氏沼虾幼体的肠道非常细小,不易分离取出,研究表明,肠道菌群约占个体全部菌群的78%～80%[33-34],而外部使用消毒杀菌的溶剂冲洗,可以成功冲洗掉附着于幼体外表面的细菌[35-36];医学试验证明,无菌水的冲洗同样可以有效清除幼体表面附着的微生物[37-39],故笔者通过使用无菌水的多次冲洗和漂洗,去除罗氏沼虾幼体表面的微生物,提高试验的准确性,以提取到的罗氏沼虾幼体总菌群DNA来代替肠道菌群。

水生生物的优势菌群多以变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门等为主[27-30]。通过16S rRNA高通量测序技术对罗氏沼虾不同种群幼体的菌群结构进行检测,发现罗氏沼虾缅甸种群、斯里兰卡种群、越南种群、孟加拉种群和自有品种1种群幼体的肠道菌群优势菌门前3位均为变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门,是罗氏沼虾幼体的核心菌群。变形菌门内细菌种类丰富,涵盖了极为广泛的生理代谢类型[40],其中弧菌科细菌的代谢产物会引发细胞衰亡和慢性炎症,是引起慢性肠道疾病的主要因素[41],肠杆菌科的细菌可以将非必需氨基酸转化为必需氨基酸或蛋白质[42],但在虾患病时,其丰度的升高会造成健康虾类中丁酸的丰度降低,从而造成抵抗力下降[43]。本试验结果显示,5个种群的肠道菌群中变形菌门均为最优势菌(丰度均大于60%),对宿主虾的生长快慢和健康与否起决定性作用。拟杆菌门中的黄杆菌科细菌可以分解复杂的高分子物质[36],肠拟杆菌(Bacteroidesintestinalis)和卵拟杆菌(B.ovatus)等可以降解木聚糖[44-45]、阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)和果胶等植物多糖[46]。厚壁菌门则更倾向于分解多糖和多脂类物质[47]。本试验结果中,只有斯里兰卡种群的厚壁菌门丰度大于拟杆菌门,表明斯里兰卡种群对饲料中的多脂类物质分解更加充分,宿主虾也更容易吸收脂类物质。由此可知,核心菌群主要参与生产生命活动必需物质以及分解肠道中最难分解的高分子物质,笔者认为,在罗氏沼虾幼体阶段可以通过改变其饲料中蛋白质、多糖等高分子物质的成分比例,来改变虾肠道核心菌群的种类和丰度,这可为研究罗氏沼虾肠道菌群和宿主免疫以及宿主食性之间的联系提供前期资料。

与本研究结果类似:Zhang等[29]发现,克氏原螯虾肠道菌群中的优势菌群为变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门;曾晨爔等[30]发现日本囊对虾的肠道中的优势菌群为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和梭杆菌门。金若晨[27]研究表明,健康和患病的凡纳滨对虾肠道菌群中的优势菌门均为拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门,与本试验研究结果存在差异的是菌门的丰度大小不同,这可能是由于试验虾的种类不同所致。洪斌等[48]在对比研究凡纳滨对虾和罗氏沼虾的肠道微生物的过程中发现,罗氏沼虾肠道中的优势菌门为厚壁菌门、变形菌门和拟杆菌门。董学兴等[32]研究不同养殖条件下罗氏沼虾的肠道菌群,发现其不同养殖条件下的优势菌门相类似,单养罗氏沼虾的优势菌群为变形菌门和厚壁菌门。这与本试验结果差异较大,可能是因为养殖环境、养殖时间等的不同,或因试验所用罗氏沼虾所处的成长阶段有很大差别。以上研究结果表明,正常健康虾类的肠道菌群优势菌门均为变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门,不同种类虾以及同种虾不同种群间的肠道菌群结构存在一定的共性,但物种丰度存在差异,同时也证明了笔者采用罗氏沼虾幼体直接进行16S rRNA测序开展肠道菌群研究的可信度与可行性。

3.2 罗氏沼虾幼体肠道菌群功能预测分析

本研究中PICRUSt功能预测结果显示,罗氏沼虾肠道菌群的基因功能主要与新陈代谢类功能有关,包括碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢等,表明肠道菌群积极参与了罗氏沼虾的基础生理代谢过程。有研究表明,肠道菌群参与控制能量代谢[49]与氨基酸代谢[50],向宿主提供营养,与宿主建立共生关系,与宿主的免疫系统相互作用[51]。这主要是由优势菌门基因功能决定的。变形菌门内的一些细菌会进行氨基酸代谢为宿主提供生存的必要条件[43];拟杆菌门和厚壁菌门是鱼虾等水生动物体内的益生菌[52];厚壁菌门与拟杆菌门的比值降低,可以降低脂肪沉积,改善肌肉的风味[53]。故笔者推测,本研究中罗氏沼虾肠道中厚壁菌门与拟杆菌门的比值同样会影响虾肉的风味,两菌门比值在斯里兰卡种群中大于1,在其他4个种群中小于1,猜测斯里兰卡种群的肉质会比其他种群含脂质多,相关验证还需后期对各种群虾的肌肉营养成分进行检测。笔者认为,在之后的生产中,可以因此改变肠道菌群的种类和丰度,生产出符合市场口味的罗氏沼虾。

4 结 论

罗氏沼虾的肠道菌群结构,不同种群之间存在共性,其优势菌门为变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门,同时又存在一定的差异。不同种群罗氏沼虾幼体肠道菌群研究,可为进一步研究不同种群罗氏沼虾的生长发育机制打下基础。另外,肠道菌群的优势菌门在罗氏沼虾的碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢活动中发挥了主要作用,也可为开发罗氏沼虾幼体孵育益生菌提供参考。