马氏珠母贝组蛋白乙酰化修饰相关基因的分子进化及功能分析

张明 杨帅 曹艳飞 卢晓文 焦钰

摘要：【目的】分析組蛋白乙酰化修饰相关基因的分子进化及其在马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）植核后的表达变化，明确组蛋白乙酰化修饰在植核免疫中的作用，为合理控制植核免疫反应提供理论依据。【方法】通过生物信息学分析方法对马氏珠母贝、长牡蛎、斑马鱼及人类等9个物种的组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）进行全基因组鉴定，并分析其分子进化历程，同时通过已有的转录组数据分析马氏珠母贝HAT和HDAC基因在植核后的表达变化，采用组蛋白H3/H4总乙酰化定量分析试剂盒检测马氏珠母贝植核后血细胞组蛋白H3/H4乙酰化水平。【结果】HAT和HDAC基因家族在9个物种基因组中的数目差异不明显，其原始共同祖先（MRCA）共包含8个HAT基因家族的9个基因及19个HDAC基因家族的22个基因。马氏珠母贝基因组含有2个HAT家族（GNAT和MYST）的8个基因（2个GNAT类基因，6个MYST类基因）；HAT基因家族成员中含有18个保守氨基酸序列，且所有MYST类基因均含有MOZ_SAS结构域，GNAT类基因则含有Hat1_N或Acetyltransf_1结构域，即具有较高的保守性。马氏珠母贝基因组含有13个HDAC家族的18个基因，包含3个I类、3个II类、10个Ⅲ类和2个IV类。其中，HDAC Ⅲ类基因家族包含3个保守氨基酸序列，HDAC I/II/IV类基因家族包含21个保守氨基酸序列，但分布位置和序列组成差异明显，说明该家族成员结构具有多样性。马氏珠母贝、长牡蛎和人类中HDAC Ⅲ类基因均包含1～2个SIR2结构域，HDAC I/II/IV类基因包含1个或多个Hist-deacety1结构域。在马氏珠母贝血细胞转录组中可检测到所有的HDAC和HAT基因，HDAC基因在植核后的表达呈动态变化，而多数HAT基因表达未发生变化；植核后6、12和24 h马氏珠母贝血细胞组蛋白H3和H4的乙酰化修饰水平显著上升（P<0.05），至植核后48 h组蛋白H3仍保持较高乙酰化水平，而组蛋白H4乙酰化水平恢复正常。【结论】组蛋白乙酰化修饰相关基因的基因组拷贝数、结构域组成及保守氨基酸序列等在不同物种间具有保守性，且组蛋白乙酰化修饰参与调控马氏珠母贝的植核免疫。

关键词：马氏珠母贝；组蛋白；乙酰化修饰；植核免疫

中图分类号：S968.316.1                    文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2023）02-0575-11

Abstract：【Objective】To analyze molecular evolution of histone acetylation modification related genes and expression changes of the genes in Pinctada fucata martensii after nucleus transplantation， and to make clear the function of histone acetylation modification on nucleus transplantation immunity， so as to provide theoretical and technical guidance for appropriate control of immune response to nucleus transplantation. 【Method】Whole genome identification of histone ace-tylase （HAT） and histone deacetylase （HDAC） related genes in 9 species including P. fucata martensii， Crassostrea gigas， Danio rerio and Homo sapiens was operated through bioinformatics methods， and molecular evolution of the genes was analyzed. Based on transcriptomes data already obtained， expression change of HAT and HDAC genes in P. fucata martensii after nucleus transplantation， and hemocyte histone H3/H4 acetylation level was determined using histone H3/H4 total acetylation quantitative analysis kit. 【Result】The numbers of HAT and HDAC gene families in the genomes of 9 species varied inobviously， and the most recent common ancestor （MRCA） included 9 genes from 8 HAT gene families and 22 genes from 19 HDAC gene families. P. fucata martensii genome contained 8 genes （2 GNAT-like genes and 6 MYST-like genes） from 2 HAT families （GNAT and MYST）； HAT gene family members contained 18 conserved amino acid sequences， and all existing MYST-like genes contained MOZ_SAS domain and GNAT-like genes contained Hat1_N or Acetyltransf_1 domains， indicating that the sequences were highly conserved. P. fucata martensii genome contained 18 genes from 13 HDAC gene families， including 3 genes in Class I， 3 in Class II， 10 in Class III and 2 in Class IV. HDAC Class III gene family contained 3 conserved amino acid sequences， and HDAC Class I/II/ IV gene families contained 21 conserved amino acid sequences， but they were distributed in different positions and had different sequence composition， indicating that the structure of the family members was diverse. HDAC Class III genes in P. fucata martensii， C. agigas， and H. sapiens contained from 1 to 2 SIR2 domains， and HDAC Class I/II/IV genes contained one or more Hist-deacety1 domains. Hemocytes transcriptome of P. fucata martensii contained all of the detected HDAC and HAT genes， and expression of HDAC genes changed dynamically after nucleus transplantation， but most expression of HAT genes did not change； acetylation modification level of histone H3 and histone H4 increased significantly at 6， 12 and 24 h after nucleus transplantation in P. fucata martensii （P<0.05）， and at 48 h， the acetylation level of histone H3 was still high， while the acetylation level of histone H4 returned to normal. 【Conclusion】Genome copy number， domain composition and conserved amino acid sequence of histone acetylation related genes are conserved in different species， and histone acetylation modification is involved in regulation of immune response to nucleus transplantation in P. fucata martensii.

Key words： Pinctada fucata martensii； histone； acetylation modification； nucleus transplantation immunity

Foundation items： Guangdong Natural Science Foundation （2021A1515011199）； Guangdong Education Department Characteristic Innovation Project of Higher Learning Institutes （2021KTSCX041）

0 引言

【研究意义】乙酰化修饰（Acetylation）是指将乙酰辅酶A的乙酰基团转移至蛋白氨基酸残基上，此修饰过程在组蛋白及其他蛋白上均可发生。组蛋白乙酰化修饰是重要的表观遗传调控方式之一，由组蛋白乙酰转移酶（Histone acetylase，HAT）和组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase，HDAC）共同调控（陈宇等，2019；马田等，2022）。组蛋白修饰参与调控蛋白活性及基因转录，在免疫调节和染色质结构中发挥重要作用。珍珠贝生产过程中通常伴随着贝体免疫排斥反应，因此，开展乙酰化修饰研究对了解功能基因的表达及调控具有重要意义，可为进一步揭示珍珠贝植核免疫的分子调控机制提供理论依据。【前人研究进展】HAT和HDAC可作用于组蛋白N端的赖氨酸残基，通过改变组蛋白乙酰化修饰状态来激活或抑制基因转录（Kouzarides，2000；Lusser et al.，2001；姜绮霞和袁洪，2007）。根据序列同源性，HAT主要分为GNAT和MYST两大类（Berger，1999；Dyda et al.，2000）。其中，GNAT主要包括PCAF、Gcn5、Elp3、Hpa2和Hat1等，MYST主要包括Sas3、Morf、Tip60、MOZ、Hbo1和Sas2等。HDAC主要分为四大类（Smith et al.，2008；Haberland et al.，2009）：I类包括HDAC1～HDAC3和 HDAC8，与酵母RPD3同源；II类包括HDAC4、HDAC5、HDAC7和HDAC9，与酵母HDA1同源；III类包括Sirtuins1～Sirtuins7，与沉默调节蛋白（Sirtuins）同源，为NAD+依赖型Sir2超蛋白家族，是非典型的HDAC家族；IV類包括HDAC11，是最短的HDAC。其中，I、II、IV类统称为Rpd3/Had1-like HDAC家族，在细胞免疫耐受、免疫调控等方面发挥重要作用（赖星等，2011）。HAT主要对组蛋白H2A、H2B（Buerki et al.，2008；Schug et al.，2010）、H3（Saha et al.，2007）和H4（Adcock et al.，2006）末端的赖氨酸残基进行乙酰化修饰，从而选择性激活基因转录（吕琳等，2008）； HDAC的作用恰好相反，促使组蛋白发生去乙酰化，而抑制基因转录（Yang and Seto，2007；Hyndman，2020）。HAT与HDAC间的动态平衡对维持生物体的生命活动十分重要，若打破该平衡将会影响生物体代谢、生长发育等生命活动，从而引发疾病（Saha and Pahan，2006；Wang et al.，2009）。已有研究证实，赖氨酸乙酰转移酶2B的异常表达致使IL-10表达下降而引发肠炎（Bai et al.，2016）。此外，乙酰化修饰可调控炎症因子NF-кB和MKP-1，通过改变炎症因子NF-кB与DNA的结合能力及转录因子活力，而调控炎症反应（Pan et al.，2010），即乙酰化修饰还与炎症反应密切相关。马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）是我国生产海水珍珠的主要贝类，其人工养殖过程中需将供体贝的细胞小片和珠核植入受体贝中（王梅芳和余祥勇，2010），植入后围绕珠核形成珍珠囊并分泌珍珠质，进而形成珍珠（焦钰等，2010；符韶等，2013）。但在珍珠的生产过程中，由于植核手术导致的创伤及植核过程中的病原体感染等，通常促使植核贝出现免疫排斥现象，导致珍珠产量下降（焦钰等，2010；Kishore and Southgate，2015）。因此，如何减少植核后供体与受体间的免疫排斥反应是马氏珠母贝养殖过程的关键。【本研究切入点】尽管目前已有较多研究报道了珍珠贝植核后的免疫反应机制，且获得大量参与植核免疫的相关基因和信号通路，但这些基因的表达调控机制尚不清楚。【拟解决的关键问题】鉴于组蛋白乙酰化修饰在基因表达和免疫反应中的调控作用，以马氏珠母贝为研究对象，通过分析组蛋白乙酰化修饰相关基因的分子进化及其在植核后的表达变化，探究组蛋白乙酰化修饰在植核免疫中的作用，以期为合理控制植核免疫反应提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 HDAC和HAT筛选

从NCBI下载马氏珠母贝、长牡蛎（Crassostrea gigas）、帽贝（Lottia gigantea）、章鱼（Octopus bima-culoides）、海兔（Aplysia californica）、海蠕虫（Capitella teleta）、水蛭（Helobdella robusta）、斑马鱼（Danio rerio）及人类（Homo sapiens）的蛋白序列。使用KEGG和Nr进行注释分析，以BLAST进行校正（E value≤1e-5），并采用InterProScan和SMART预测其功能结构域。根据上述预测结果，得到9个物种的全部HAT和HDAC基因。具有2种酶的特有功能结构域，且与HAT和HDAC同源（E value≤1e-5）即被鉴定为HDAC或HAT。

1. 2 HDAC和HAT基因家族进化分析及Motif预测

利用马氏珠母贝、长牡蛎、帽贝、章鱼、海兔、海蠕虫、水蛭、斑马鱼和人类9个物种的所有基因序列构建系统发育进化树，以模式生物人类和斑马鱼的化石时间为参照，参考本课题组前期使用CAFE软件的预测结果（de Bie et al.，2006；郑哲，2017），筛选出不同分化节点9个物种各HAT和HDAC基因家族及其基因数目，分析各物种中HDAC和HAT的扩张或收缩情况。此外，利用MEGA 6.0中的最大似然法构建马氏珠母贝、长牡蛎、人类的HDAC和HAT系统发育进化树，通过BioEdit进行多序列比对，并以MEME （http：//meme-suite.org/tools/meme）对组蛋白HDAC和HAT进行Motif预测。

1. 3 转录组数据分析

马氏珠母贝植核后不同时间点的转录组数据来自本课题组前期研究成果（Jiao et al.，2019）。血细胞转录组中的同种植核是指供体贝和受体贝均为马氏珠母贝，而异种植核的供体贝为大珠母贝（Pinctada maxima）、受体贝为马氏珠母贝。

1. 4 组蛋白乙酰化水平检测

1. 4. 1 试验材料 选取的马氏珠母贝采自我国湛江大井海区，对其进行植核手术，植核后将马氏珠母贝置于装有海水的水箱中养殖，对照组为正常养殖的马氏珠母贝。分别在植核后6、12、24和48 h，使用2 mL注射器从每组5只马氏珠母贝中提取血淋巴，4 ℃下3000 r/min离心6 min，收集血细胞，-80 ℃保存备用。

1. 4. 2 总组蛋白提取 采用总组蛋白提取试剂盒（EpiQuikTM Total Histone Extraction Kit）提取组蛋白，以1×Pre-Lysis Buffer将血细胞样品配制成×107个/mL的细胞悬液，冰上轻轻摇晃10 min后，4 ℃下10000 r/min离心1 min，弃上清液。收集的沉淀用3倍体积的Lysis Buffer进行悬浮，冰上孵育30 min，4 ℃下12000 r/min离心5 min，使用移液枪将上清液转移至干净的EP管中。将Balance Buffer和DTT Solution按1∶499的比例配制成Balance DTT Buffer，然后按1∶3的比例添加至上清液中即获得组蛋白， -80 ℃保存备用。

1. 4. 3 组蛋白浓度检测 使用1×PBS将小牛胚胎血清（BSA）标准溶液配制成合适的浓度梯度，通过酶标仪测定OD值并绘制标准曲线。根据测定的样品OD值和标准曲线，计算出不同时间点马氏珠母贝血细胞在不同试剂处理下的组蛋白浓度。

1. 4. 4 组蛋白总H3和H4乙酰化水平检测 使用组蛋白H3和H4总乙酰化定量分析试剂盒（EpiQuikTM Total Histone H3/H4 Acetylation Detection Fast Kit）进行检测。设空白组、标准品组和样品组所需孔数，每孔添加50 μL抗体缓冲液。标准组酶标孔添加不同浓度的组蛋白H3/H4标准品1 μL，样品组酶标孔添加不同时间点的马氏珠母贝血细胞组蛋白200 ng，空白组不添加任何试剂。室温孵育1～2 h后，每孔添加150 μL稀释的洗涤液，反复洗涤3次，再每孔添加50 μL稀释的Detection Antibody，摇床混匀1 h。混匀结束再反复洗涤6次，每孔添加100 μL Color Developer，避光孵育2～10 min后每孔添加50 μL终止液，放入酶标仪中读取吸光值，绘制标准曲线并计算组蛋白H3/H4乙酰化水平。

2 结果与分析

2. 1 HAT和HDAC筛选结果

对马氏珠母贝、长牡蛎、帽贝、章鱼、海兔、海蠕虫、水蛭、斑马鱼和人类9个物种的HAT和HDAC全基因组进行筛选，结果（表1）表明，人类和马氏珠母贝中均含有8个HAT和18个HDAC，长牡蛎中含有6个HAT和20个HDAC。HAT在马氏珠母贝中含有2个GNAT类，分别是10009612（KAT1）和10020342（KAT2）；6个MYST类，分别是10020994（KAT5）、10019553（KAT8）、10028977（KAT8）、10028973（KAT8）、10022287（KAT6B）和10009751（KAT7）。HDAC在马氏珠母贝中有3个I类HDAC（10023132、10032700和10021146）、3个II类HDAC（10001025、10006221和10009193）、10个III类HDAC（10032193、10009359、10032192、10014771、10027317、10031932、10020349、10028169、10005793和10009979）及2个IV类HDAC（10020335和10006290）。

2. 2 HAT和HDAC基因家族进化分析结果

追溯组蛋白HAT和HDAC基因家族的进化过程，发现原始共同祖先（MRCA）共包含8個HAT基因家族的9个基因及19个HDAC基因家族的22个基因（图1）。在物种进化过程中，软体动物的共同祖先（节点B）HAT基因家族数目减少至6个，长牡蛎和马氏珠母贝的共同祖先基因数目未发生变化，但长牡蛎的基因数目减少1个，马氏珠母贝则增加1个。人类HAT基因家族还保留着与原始祖先相同的数目，仅基因数目减少1个。此外，双壳软体动物的共同祖先（节点E）HDAC基因家族数目有16个基因家族的19个基因得到保留，长牡蛎的基因家族数目减少1个、基因数目增加2个，马氏珠母贝的基因家族数目减少3个、基因数目均减少1个。

构建马氏珠母贝、长牡蛎、人类的HAT和HDAC家族基因进化树，以探究三者间的进化关系，结果显示，HAT基因的GNAT家族有7个基因，MYST家族有15个基因，两大家族的基因各自聚为一支，相同家族基因也聚在同一分支，且每支均包含马氏珠母贝、长牡蛎和人类3个物种（图2）。Motif预测结果显示，HAT基因家族含有18条序列（表2），其中，MYST家族基因中均包含保守的序列1、序列2和序列3，GNAT家族基因中均包含序列5、序列8和序列14，其组成与进化树结构基本一致。HDAC家族基因进化树与HAT基因进化树的结构相似，马氏珠母贝、长牡蛎和人类中HDAC基因多数相同家族基因呈聚集状态，且每个分支均包含马氏珠母贝、长牡蛎和人类3个物种（图3）。

对马氏珠母贝、长牡蛎和人类的HDAC I、II和IV类基因进行Motif预测，结果共发现21条保守氨基酸序列（图4），根据其保守序列分布位置及组成结构的不同，可确认HDAC I、II和IV类基因家族成员结构上存在多样性。HDAC Ⅲ类基因家族可分为两大类，具有7个保守结构域（图5），在马氏珠母贝、长牡蛎和人类基因中均包含有序列2、序列4和序列5；序列7仅在长牡蛎和马氏珠母贝基因中存在，在人类基因中未发现，故推测序列2、序列4和序列5在马氏珠母贝、长牡蛎及人类进化过程中必不可少。

对马氏珠母贝、长牡蛎、人类的HAT和HDAC基因家族编码蛋白序列结构域进行SMART预测，结果显示，马氏珠母贝、长牡蛎和人类HAT基因MYST家族成员均具有MOZ_SAS结构域，且部分基因能与其他结构域发生整合，如KAT6基因具有PHD和H15结构域，KAT7基因具有ZnF_C2H2结构域。此外，MYST家族含有AT_hook结构域，在动物中AT_hook结构域通过与染色体结合，调控基因转录和染色质结构，进而影响生物的生长发育过程。GNAT家族成员均具有Hat1_N或Acetyltransf_1结构域，且KAT2B、KAT2基因中具有BROMO和PCAF_N结构域。在进化过程中，结构域的组成在不同物种间尚未发生改变（表3）。马氏珠母贝、长牡蛎和人类的HDAC II类基因具有2个及2个以上Hist-deacety1结构域，HDAC I类和IV类基因具有1个Hist-deacety1结构域，HDAC III类基因具有1～2个SIR2结构域（表4）。

2. 3 HAT和HDAC基因在植核后的表达变化情况

利用本课题组前期的转录组数据分析同种植核和异种植核后不同时间点HAT和HDAC基因的表达变化，结果表明，同种植核后HAT基因表达变化较小（变化倍数小于2），而HDAC6/10、HDAC8基因分别在植核后6 h和3 d呈上调表达，有2个Sir2基因则在植核后3和12 d呈上调表达（图6-A）。异种植核后，KAT8基因在植核后24 h呈下调表达，KAT1基因在植核后6 h的相对表达量显著下调，但在植核6 d后又显著上调（P<0.05，下同），其他基因无显著变化（P>0.05）；HDAC1/2基因在植核后12 h呈上调表达，有2个Sir2基因及1个HDAC3基因和1个HDAC8基因在植核后3 d呈上调表达，有2个Sir2基因分别在植核后6和12 h呈上调表达，有2个HDAC4/5基因则在植核后12 h呈下调表达（图6-B）。

2. 4 植核后组蛋白乙酰化水平检测结果

对植核处理前及植核后（6、12、24和48 h）马氏珠母贝组蛋白H3和H4的乙酰化水平进行检测，结果（图7）表明，在植核后6、12和24 h马氏珠母贝组蛋白H3和H4显著上调，组蛋白H3在植核后48 h仍保持较高乙酰化水平，而组蛋白H4乙酰化水平恢复正常。

3 讨论

组蛋白的乙酰化和去乙酰化修饰分别由HAT和HDAC催化完成，且参与调控炎症相关基因的表达和染色质结构（Marampon et al.，2019），在细胞的分化、生长及增殖等过程中发挥重要作用，但至今有关软体动物组蛋白乙酰化和去乙酰化修饰的研究相对较少。根据序列同源性，HAT主要分为GNAT和MYST两大类，马氏珠母贝中包含有2个GNAT家族的2个基因（KAT1和KAT2）及4个MYST家族的6个基因［KAT8（包含3个基因）、KAT6B、KAT5和KAT7］。进化分析结果显示，在马氏珠母贝、长牡蛎和人类中相同类别的基因呈聚集状态，说明在无脊椎动物和脊椎动物分化后HAT基因才开始分类。序列分析结果表明，HAT家族含有18个保守氨基酸序列，其中，MYST家族基因中均包含序列1、序列2和序列3，而GNAT家族基因中均包含序列5、序列8和序列14，说明不同基因家族在进化过程中形成不同的保守氨基酸序列，同一类基因家族具有类似的保守氨基酸序列，即具有较高的保守性（Heintzman et al.，2009）。此外，MYST家族成员均含有MOZ_SAS结构域，GNAT家族成员均含有Hat1_N或Acetyltransf_1结构域，进一步说明在家族基因功能发挥方面这些结构域扮演着重要角色。

HDAC还在生物免疫反应及基因表达调控等方面发挥重要作用。至今已发现有18种HDAC，根据序列同源性可分为四大类（I～IV）（Smith et al.，2008；Haberland et al.，2009；曹端方和杨娜，2015）。在马氏珠母贝基因组中包含3个I类、3个II类、10个III类及2个IV类。I、II、IV类HDAC又统称为Rpd3/Had1-like去乙酰化酶家族（de Ruijter et al.，2003），含有的催化核心結构域同源性较高，但其分布具有多样性（钟理等，2014）。Motif序列分析结果显示，Rpd3/Had1-like去乙酰化酶家族存在明显的序列差异，虽然含有21个保守氨基酸序列，但在不同基因家族中的分布位置及序列组成差异明显，故推测该家族成员结构的多样性与乙酰化修饰密切相关。由构建的进化树可看出，HDAC II类基因大多先在物种内呈聚集状态，然后在马氏珠母贝、长牡蛎和人类间聚集；HDAC I和IV类基因则呈物种间聚集；马氏珠母贝、长牡蛎和人类中相同家族的HDAC基因多聚集在一起，说明不同类型的HDAC基因包含有脊椎动物和无脊椎动物的原始共同祖先。少数HDAC基因与其他基因差异较明显，单独聚集为一支，可能是这些基因在进化过程中发生了较大变异。HDAC III基因类家族SIR结构域序列分析结果显示含有3个保守氨基酸序列，其中所有Sir2超家族结构域均含有序列1和序列2，但序列3仅单独存在于进化树的一支，与林莹等（2017）的研究结果相似。结构域分析结果显示，Rpd3/Had1-like去乙酰化酶家族包含1个或2个以上的Hist-deacety1结构域，HDAC III类基因则包含1～2个SIR2结构域，与Gregoretti等（2004）的研究结果一致，说明HDAC家族基因在功能上具有保守性。

同种植核和异种植核后马氏珠母贝血细胞转录组分析结果显示，在血细胞转录组中可检测到所有的HDAC和HAT基因，且表达水平均较高，植核后部分HDAC基因及2个HAT基因的表达水平发生变化，说明HDAC和HAT参与调控马氏珠母贝的植核免疫反应。此外，马氏珠母贝植核后6、12和24 h的组蛋白H3和H4乙酰化修饰表达水平显著上升，说明组蛋白乙酰化修饰状态在植核后发生改变，进一步证实组蛋白乙酰化参与调控马氏珠母贝的植核免疫。

4 结论

组蛋白乙酰化修饰相关基因的基因组拷贝数、结构域组成及保守氨基酸序列等在不同物种间具有保守性，且组蛋白乙酰化修饰参与调控马氏珠母贝的植核免疫。

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（責任编辑 兰宗宝）