六盘山野生大球盖菇分离鉴定及生物学特性初探

李 颖 高有钱 林戎斌 贾宝光 王正安 贾 旭

（1.宁夏农林科学院固原分院 宁夏 固原 756000；2.固原市六盘山林业局 宁夏 固原 756000;3.福建省农业科学院土壤肥料研究所 福建 福州 350013）

大球盖菇（Stropharia rugosoannulata）又名皱环球盖菇、 酒红色球盖菇、 裴氏球盖菇， 属于担子菌门（Basidiomycota）、 伞菌纲（Agaricomycetes）、 伞菌目（Agaricaler）、 球盖菇科（Strophariaceae）、 球盖菇属（Stropharia）[1]。 大球盖菇作为栽培管理粗放的特色食用菌之一，其质地鲜嫩，对人体有益的多糖类、蛋白质、矿质元素及维生素等物质含量丰富，并具有抗肿瘤、抗氧化等功效，是一种集营养、疗效于一体的食、药兼用菌，具有广阔的市场前景及商业生产潜力。 我国云南、吉林、西藏等地有野生大球盖菇分布[2]，国内专家学者也对其做了相关研究报道。 李碧琼等[3]首次对莆田老鹰尖自然保护区的野生食用菌资源进行调查，发现了野生大球盖菇。 颜淑婉和刘胜贵等[4-5]对其大球盖菇生物学特性进行了研究， 确定了适宜其生长发育的碳源、氮源、pH 及生长温度。 马令法等[6]的研究表明，大球盖菇菌核生长、菌落形成和菌丝生长的最优碳源是葡萄糖，最优氮源是酵母膏。 萨仁图雅等[2]的研究表明，不同品种的大球盖菇菌丝生长对碳源和氮源的需求不同。 大球盖菇属草腐菌，其抗逆性强，生态习性范围广，野生大球盖菇主要生长在阔叶林下的落叶层及针阔混交林中。 我国西北地区生态环境条件十分脆弱，生物种类相对稀少，大多数物种表现为抗旱、抗寒及耐盐碱等生物学特性，研究六盘山的野生大球盖菇资源， 对保护当地脆弱的生态系统和生物多样性， 同时对发展当地的经济具有重要意义与科学价值。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

六盘山国家级自然保护区 （35°15′~35°41′ N，106°09′～106°31′ E） 位于宁夏南部黄土高原西部，处于干旱向半湿润过渡的地带， 是黄土高原植被覆盖良好、生物多样性、径流与森林资源最丰富的地区之一，素有黄土高原的“绿岛”和“湿岛”之称，是我国西北地区重要的水源涵养基地和生态屏障， 横贯陕甘宁3 个省份，总面积为6.78 万hm2，是宁夏3 大次生林区之一，种质资源丰富，素有“西北种质资源基因库”之称，特有的地形地貌和气候为野生食用菌的繁衍提供了得天独厚的环境条件。

1.2 供试材料

1.2.1 子实体 子实体2021 年9 月28 日采集于六盘山国家森林公园。

1.2.2 培养基 PDA 固体培养基： 马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L，自然pH。

基础培养基：葡萄糖20 g、尿素2 g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5 g、琼脂18 g、去离子水1 000 mL。

1.3 试验方法

1.3.1 组织分离及纯化 采用组织分离法对样本子实体进行菌种分离。 首先用70%酒精棉擦洗菌盖及菌柄部位进行表面消毒，在酒精灯火焰附近，用手将子实体从菌柄基部向菌盖处撕开， 用燃烧后的手术刀片将菌盖与菌柄之间的菌肉切成小方块， 然后用灭过菌的镊子夹取一小块菌肉组织， 放入事先准备好的装有无菌培养基的PDA 平板培养基中， 置于25℃培养箱中黑暗培养， 标记为Q1。 菌丝直径达到2 cm 后，进行纯化培养。1.3.2 菌种鉴定 采用真菌基因组提取试剂盒 （天根） 分别对大球盖菇的子实体和分离培养得到的菌丝体进行基因组DNA 提取。 采用通用引物ITS1 和ITS4 （TS1：5-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3；ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）用于rDNA ITS 区段的PCR扩增。扩增体系为50 uL，其中包含35.5 uL去离子水、5 uL10×PCR buffer、4 uL dNTPs（2.5 mmol/L）、ITSl 和ITS4 引物各2 uL、0.5 μL Tag DNA 酶（5 U/uL）、1 uL 模板DNA（浓度20～50 mg/L）。 PCR 反应条件：95℃预 变 性5 min；94℃变 性30 s，55℃退 火30 s，72℃延伸40 s，35 个循环；72℃反应7 min。 PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后4℃保存。1.3.3 生物学特性分析 采用微生物平板培养法，通过测定不同碳源、 氮源及无机盐培养基上菌丝长势、生长指数、菌落直径、菌落形成时间、菌落长势、菌丝生长速度等指标来研究不同培养基配方对球盖菇属菌丝生长的影响， 并采用十字交叉划线法标记1 次菌落直径，持续标记3 次，记录菌丝日均长速和菌丝长度。 每个配方5 个重复，注意记录霉变情况，对霉变的平板要及时处理。

（1）碳源试验。以基础培养基中葡萄糖20 g 的含碳量为标准，分别以相同含碳量的蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、 甘露醇、 乳糖代替基础培养基中的葡萄糖，并以不添加任何碳源的基础培养基作对照，研究不同碳源物质对供试菌菌丝生长的影响。

（2）氮源试验。 以基础培养基中尿素2 g 的含氮量为标准，分别以相等含氮量的硝酸钾、蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵、尿素、酵母粉代替基础培养基中的尿素，并以不添加任何氮源的基础培养基作对照，研究不同氮源物质对供试菌菌丝生长的影响。

（3）无机盐试验。 分别用硫酸铁、硫酸钙、硫酸锌、硫酸铜和硫酸锰代替基础培养基中的硫酸镁，并以不加硫酸镁的基础培养基作对照， 其中常量元素添加量为0.5 g/L，微量元素添加量为0.06 g/L，研究不同无机盐物质对供试菌菌丝生长的影响。

1.4 项目测定

测定不同培养基上球盖菇的菌落直径， 并对菌落长势进行评分，研究不同碳源、氮源和无机盐对球盖菇菌丝生长的影响。 观察、记录每个菌株的菌落直径、颜色、长势、疏密度、平均生长速率等情况。

具体评分标准：菌丝长势浓密、均匀，5 分；菌丝长势较浓密、较均匀，4 分；菌丝长势较稀疏、较均匀，3 分；菌丝长势较稀疏、不均匀，2 分；菌丝长势稀疏、不均匀，1 分。

菌落直径（mm）：用直尺任意测量3 次，取平均值。

菌丝生长指数=菌丝长势评分×菌丝生长速率；菌丝日均长速（mm/d）=[（菌落直径-6）/2]/培养天数。

1.5 数据处理

采用Excel、SPSS 17.0 数据处理系统对试验数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 分离培养

在秋季， 宁夏六盘山国家森林公园发现获得野生大球盖菇子实体，其单生或群生于枯枝落叶层中，菌盖直径5.5～8.0 cm，扁半球形至扁平，湿时稍黏，盖缘光滑或覆丛毛状鳞片，附着较多的菌幕残片，深葡萄酒褐色。 菌褶直生，膜质，浅灰色至紫褐色；褶缘锯齿状，白色。 菌柄长6～12 cm，直径0.9～2.0 cm，圆柱形至基部近球根状，白色至奶油色菌环厚。 野生大球盖菇子实体经组织分离后获得纯种菌丝Q1， 对大球盖菇菌落的平板培养进行观察， 可以看出菌丝生长浓密， 颜色为洁白色， 菌落绒毛状， 圆形， 平坦，有放射状纹。 对大球盖菇菌株的菌丝进行显微观察， 发现菌丝细胞含有双核， 且具有明显的锁状联合结构。 从菌丝生长速率来看，大球盖菇Q1 菌丝生长速率为2.68 mm/d（图1）。

图1 野生大球盖菇子实体及菌落Q1 的平板培养

2.2 菌种鉴定

测序结果登录GenBank 核酸序列数据库进行Blast 比对， 与登录号MH860190.1 （Stropharia rugosoannulata）的菌种覆盖度最高达100%，相似性达99.85%。 下载相似高的ITS 序列，用Clustal W 进行序列比对，基于分离株Q1 以及来自GenBank 的最相似球盖菇属15 个种的ITS 序列，用MEGA2.0 软件采用ML 法构建系统树（采用默认值，图2）。 从系统发育树可看出，菌种Q1 与球盖菇属中的大球盖菇聚为一支，结合形态特征，鉴定分离菌种为大球盖菇。

图2 基于ITS 序列构建的系统发育树

2.3 菌丝生物学特性

2.3.1 不同碳源对大球盖菇菌丝生长发育的影响6 种碳源均可以被大球盖菇菌丝所利用（表1），说明大球盖菇Q1 对碳源利用谱较广。 其中以葡萄糖和蔗糖作为碳源时大球盖菇菌丝长势最强， 菌丝健壮而浓密，与其他碳源相比差异显著。 其按照菌丝生长速率顺序为葡萄糖=蔗糖＞可溶性淀粉＞麦芽糖=乳糖=甘露醇＞无碳源。 结合菌丝长势与密度发现，大球盖菇菌丝生长的最适碳源为葡萄糖和蔗糖。

表1 不同碳源对大球盖菇菌丝生长及生长势的影响

2.3.2 不同氮源对大球盖菇菌丝生长发育的影响由表2 可知， 结合大球盖菇菌丝生长势和生长速率分析， 菌丝在酵母浸粉为氮源的培养基上生长快而健壮，菌丝浓密，与其他氮源培养基上的菌丝生长指数差异显著； 菌丝在硫酸铵和硝酸钾为氮源的培养基上菌丝生长速率较快， 在硫酸铵培养基上生长快而较健壮，菌丝较浓密，但是菌丝在硝酸钾培养基上长势差，菌丝稀疏，故不宜选用硝酸钾。 试验表明，大球盖菇菌丝生长的最适氮源为酵母浸粉。

表2 不同氮源对大球盖菇菌丝生长及生长势的影响

2.3.3 不同无机盐对大球盖菇菌丝生长发育的影响不同无机盐对大球盖菇菌丝生长具有一定的影响，在添加硫酸铁的培养基上，菌丝生长速率最快，但菌丝长势一般。 在不添加无机盐的培养基上，与其他培养基的菌丝生长指数相比差异显著，菌丝长势较强，密度较浓密，试验表明，大球盖菇菌丝生长过程中可不添加无机盐（表3）。

表3 不同无机盐对大球盖菇菌丝生长及生长势的影响

3 讨论与结论

六盘山野生大球盖菇发生季节在秋季， 单生或群生于草地或枯枝落叶层， 采用组织分离法对野生大球盖菇子实体进行分离，成功分离、纯化得到野生大球盖菇菌种Q1。 通过ITS 序列分析法对供试子实体与菌丝体进行扩增、测序、对比，验证子实体为大球盖菇子实体的分离物，分离获得的菌丝体Q1 为大球盖菇菌种。

大球盖菇菌丝体生长最适碳源为葡萄糖和蔗糖，最适氮源为酵母浸粉，这一结果与颜淑婉等[7]的试验中大球盖菇菌种St0128 菌丝生长适宜条件一致。 无机盐试验结果表明， 硫酸铁促进大球盖菇Q1菌丝体生长，而硫酸钙抑制菌丝体生长，结合菌丝体生长长势得出， 大球盖菇菌丝体生长最适的为不添加无机盐处理，该结果与闫培生等[8]、马令法等[6]的研究结果不同。