有机酸分析柱在饲料酸化剂质量检测中的应用研究

张天姝 杨希国 陈玉艳 李丽 刘石鑫

【摘要】建立一种采用Aminex？HPX-87H有机酸分析柱分离，高效液相色谱法同步检测饲料酸化剂中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸含量的方法。样品采用水超声提取，应用Aminex？HPX-87H有机酸分析柱，以0.01 mol/L硫酸溶液为流动相，二极管阵列检测器在210 nm进行定量检测。结果表明：有机酸标准溶液线性关系良好，相关系数均大于0.995，回收率均大于90.0%，变异系数小于10%。该方法具有专属性强、准确度高的特点。

【关键词】高效液相色谱法；酸化剂；有机酸

【DOI编码】10.3969/j.issn.1674-4977.2023.02.029 Study on the Application of Organic Acid Analysis Column in the Quality Detection of Feed Acidifier

ZHANG Tianshu1，YANG Xiguo2，CHEN Yuyan1，LI Li2，LIU Shixin2

（1.Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre，Shenyang 110036，China；2.Liaoning General Fair Testing Co.，Ltd.，Shenyang 110026，China）

Abstract：To establish an Aminex？HEPX-87H organic acid analytical column for the simultaneous determination of formic acid，acetic acid， propionic acid，butyric acid，lactic acid，citric acid and malic acid in feed acidifiers by HPLC. The samples were extracted by ultrasonic water. Aminex？HEPX-87H organic acid analysis column was used for the quantitative detection at 210 nm with 0.01 mol/L sulfuric acid solution as the mobile phase and a diode array detector. The results showed that the linear relationship of organic acid standard solution was good，the correlation coefficients were all greater than 0.995，the recoveries were all greater than 90.0%，and the coefficient of variation was less than 10%. The method has the characteristics of strong specificity and high accuracy.

Key words：high-performance liquid chromatography；feed acidifier；organic acid

饲料酸化剂是指能提高饲料酸度（降低pH值）的一类物质。它能改变饲料的适口性，降低肠道pH值，提高消化酶活性，影响胃肠道微生物组成，并且可以直接参与体内代谢、增强免疫功能，促进营养物质的吸收[1-3]。近年来，抗生素禁止用在动物饲料上，酸化剂被视为在猪饲料中能够有效替代抗生素的产品之一，在动物饲养中得到广泛应用[4]。

饲料酸化剂一般分为无机酸和有机酸，其中有机酸在饲料工业中作为饲料酸化剂被广泛应用。为了更好地掌握酸化剂产品质量，规范产品生产和使用，检测机构需要建立一种高效、便捷、快速、准确的有机酸检测方法。目前饲料中有机酸的分析方法有比色法和色谱法，比色法只能测定单一的有机酸，色谱法可以同时测定多种有机酸。应用比色法复杂而且误差大，很难满足常规测定要求。食品加工业中多采用反相色谱柱分离测定有机酸[5-7]，其准确性高、特异性强，可以同时测定多种有机酸。但同时测定甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸含量的检测方法未见报道。本实验建立了采用Aminex？HPX-87H有机酸专用分析柱分离，高效液相色谱法同步检测饲料酸化剂中7种酸含量的方法。

1材料与方法

1.1仪器和试剂

电子天平（梅特勒）；Waters 2695型高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器（Waters公司）；超声波水浴器；美国伯乐Bio-Rad Aminex？HPX-87H色谱分析柱：300 mm×7.8 mm；甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸标准品：含量大于98.0%，购置于德国Dr.Ehrenstorfer公司；硫酸为优级纯试剂；实验用水为二级水；二氧化硅由市场购買而得。

1.2标准溶液配置

0.01 mol/L硫酸溶液：准确量取0.3 mL硫酸，缓缓注入1 L水中，冷却摇匀。标准储备液：精密称取0.1 g（精确到0.00001 g）甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸标准品，用水溶解并定容至10 mL容量瓶。该标准贮备液每毫升含甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸均为10 mg。

1.3样品提取

准确称取样品1 g（精确至0.0001 g），置于100 mL容量瓶中，加入70 mL去离子水，在40℃下超声提取30 min，放至室温，用去离子水定容至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤后用高效液相色谱仪测定。

1.4色谱条件

色谱柱：Aminex？HPX-87H色谱柱（300 mm×7.8 mm）。柱温：30℃。流动相：0.01 mol/L硫酸溶液。流速：1.0 mL/ min。检测器：二极管阵列检测器。波长：210 nm。进样体积：20.00μL。

2结果与分析

2.1色谱柱的选择

有机酸为弱酸，易在水系流动相中发生解离而不被非极性键合相保留，通常采用酸性磷酸氢盐溶液抑制解离，改善有机酸的保留和分离。所以文献中大部分选择C18色谱柱，磷酸氢盐溶液作为流动相，但是磷酸氢盐溶液会对色谱柱造成损害。

Aminex HPX-87H是BioRad的离子交换色谱柱（H+型），pH范围在1～3之间，用于对含有羧酸、挥发性脂肪酸、短链脂肪酸、醇类、酮类以及许多中性新陈代谢副产物的溶液中的碳水化合物进行分析，而且该色谱柱的典型流动相是低浓度的硫酸。故本实验选用该色谱柱进行饲料酸化剂中有机酸的研究，其特异性强、准确度高。

2.2流动相的选择

Aminex？HPX-87H色谱柱的典型流动相为硫酸溶液。本实验研究了0.001 mol/L、0.005 mol/L和0.01 mol/L硫酸溶液作为流动相时的出峰情况。结果表明：3种不同浓度的硫酸溶液作为流动相时，目标峰均可以得到很好的分离，但0.001 mol/L、0.005 mol/L硫酸溶液作为流动相时，出峰时间过长，故本研究采用0.01 mol/L硫酸溶液作为流动相为最佳。混合标准溶液图谱见图1。

2.3提取液的选择

甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸均易溶于水，并且酸化剂的成分也比较简单，大部分是有机酸与无机载体混合物，所以不需要进一步净化，水提取后过滤膜直接上机测定即可。

2.4色谱柱温度的选择

Aminex？HPX-87H色谱柱的适宜温度应不超过65℃。考察30℃、35℃、40℃、50℃不同温度下各种酸的出峰情况。结果表明：随着温度的升高，各种有机酸的分离度降低，峰型不佳，经过试验研究，确定本试验的色谱柱温度为30℃。

2.5标准曲线测定

准确移取合适浓度的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸混合标准储备液适量，用水配制成浓度为5μg/mL、20μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的标准溶液，上机测定。以目标化合物峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果表明：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸在5μg/mL至1000μg/mL范围内相关系数均大于0.995，线性关系良好。在本实验条件下，将标准储备液连续稀释后添加到空白试样中，进行添加回收，根据信噪比大于10、称样量和进样量计算，得出方法定量限。结果见表1。

2.6准确度和精密度试验

采用二氧化硅为载体，准确称取空白载体1 g（精确至0.0001 g）至100 mL容量瓶中，添加不同浓度的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸混合标准溶液，密封放置24小时后按上述确定的样品提取和色谱条件进行检测，以回收率衡量准确度，以回收率的精密度衡量方法的精密度。七种有机酸的添加回收率在92.6%～102.4%之间，精密度在0.6%～ 3.5%之间，详见表2。

2.7实际样品检测

应用建立的检测方法，选取市售4种有机酸饲料添加剂进行检测，样品检测结果见表3，色谱图见图2-图5。

对实际样品的测定结果表明：利用有机酸分析柱可同时测定饲料酸化剂中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸的含量。此方法操作简单，效率高，可以满足日常检测需求。

【参考文献】

[1]赵先铭，曾清华，丁永忠.酸化剂的作用机理及其应用[J].中国饲料，2002（11），22-23.

[2]林海丹，邓宇翔，王松波，等.饲用酸化剂的作用机制和应用现状[J].广东饲料，2009，18（5）：23-25.

[3]秦圣涛，张宏福，唐湘方，等.酸化剂主要生理功能和复合酸选配依据[J].动物营养学报，2007（增刊1）：515-520.

[4]李翔，张予宏.飼料酸化剂替代抗生素的作用机制[J].饲料研究，2006（9）：22-24.

[5]赵艳，张凤枰，杨发树，等.高效液相色谱法同时测定饲料添加剂中6种有机酸含量[J].中国粮油学报，2015，30（2）：127-130.

[6]索德成，李兰，樊霞.饲用酸化剂中甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、柠檬酸的同步测定[J].饲料工业，2012，33（21）：60-62.

[7]黄志英，赵志辉，顾赛红.高效液相色谱法测定饲料酸化剂中甲酸和丙酸含量[J].上海农业学报，2010，26（3）：64-66.

【作者简介】

张天姝，女，1985年出生，高级畜牧师，硕士，研究方向为动物营养与饲料安全。

（编辑：李加鹏）