一测多评高效液相色谱法同时测定五味子中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素

翟宏焱，周光姣，王超群

（1.安徽省食品药品检验研究院，国家药品监督管理局中药质量研究与评价重点实验室，合肥 230051；2.亳州职业技术学院，安徽 亳州 236800）；3.安徽省医学科学研究院，合肥 230061；4.安徽医学高等专科学校，合肥 230601

五味子为木兰科植物五味子的干燥成熟果实，习称“北五味子”，秋季果实成熟时采摘，晒干或蒸后晒干，除去果梗和杂质。五味子具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心之功效[1]。据文献报道，五味子中含有木脂素类化合物、挥发油类和三萜类等活性成分[2]，其中木脂素类化合物约占总成分的8% (质量分数)[3]，木脂素类化合物是五味子最主要的生物活性成分之一[4]，具有保肝护肝、镇静催眠、抗氧化、增强免疫力等药理作用[5]，联苯环辛烯型木脂素是五味子具有代表性的成分，因此选择联苯环辛烯类木脂素为五味子内部质量评价指标对药材质量控制具有重要意义。常见的联苯环辛烯型木脂素有五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲等。五味子中多种木脂素类成分含量的测定已有文献报道[6‒7]，但这些方法难以在实际工作中广泛应用，其主要原因是对照品价格昂贵，货源紧缺等，因此，如何实现用单一对照品对五味子药材进行多指标的质量控制，是目前五味子质量控制中亟待解决的关键问题。

PB 试验法是Plackett-Burman 试验法的简称，通过试验设计，可以从众多影响因素中筛选出主要影响因素，准确有效地优选响应面显著因子。中心组合设计-效应面法(CCD-RSM)是近年来广泛使用的工艺优化方法，是一种非线性模型拟合，具有比单因素分析方法有效、比正交设计试验简化、比均匀设计更全面的特点[8]。

一测多评(QAMS)法即以样品中某一成分为内参比物，建立其它成分与该成分之间的相对校正因子，通过相对校正因子计算其它成分含量，实现多成分同步测定[9‒11]。该方法能有效解决对照品短缺和检测成本高的问题，尤其适用于中药材多指标成分的质量控制，该法早在2010 年已被《中国药典》(2010版)收录。有文献报道采用该方法测定五味子中8 种[12]和12 种木质素类成分含量[13]，由于指标成分太多，在实际应用中较难实现质量监测。

笔者采用Plackett-Burman设计(PBD)筛选影响色谱峰分离度的关键因素，利用中心组合设计-效应面(CCD-RSM)法对关键分析参数进一步优化，选择五味子中含量较高的五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素建立一测多评方法，以期实现五味子木脂素类成分的质量控制。五味子醇甲在五味子中含量最高，该对照品价廉易得，且2020 版《中国药典》中规定五味子醇甲作为五味子含量测定指标，故选择五味子醇甲为参照物，计算五味子醇甲与五味子甲素、五味子乙素之间的相对校正因子，利用相对校正因子计算五味子甲素、五味子乙素含量，并将结果与外标法(ESM)测得数据进行比较分析，从而验证一测多评法的准确性。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：(1) Ultimate 3000 型，配DAD检测器，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；(2)Agilent 1290 Infinit Ⅱ型，美国安捷伦科技有限公司；(3) Waters2695型，美国沃特世科技有限公司。

电子天平：(1) XP56 型，感量为0.001 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；(2) BSA224S 型，感量为0.1 mg，赛多利斯仪器(北京)有限公司。

数控超声波清洗器：TC-SY-1000 型，北京同德创业科技有限公司。

纯水/超纯水一体化系统：Milli-Q Direct 16 型，美国密理博公司。

五味子醇甲对照品：纯度(质量分数)为99.7%，编号为110857-201815，中国食品药品检定研究院。

五味子甲素对照品：纯度(质量分数)为99.5%，编号为110764-201915，中国食品药品检定研究院。

五味子乙素对照品：纯度(质量分数)为99.1%，编号为110765-201813，中国食品药品检定研究院。

甲醇：色谱纯，德国默克公司。

实验室用水均为超纯水。

五味子药材样品：从中药材市场收集10批五味子药材，具体批号及产地见表1，经安徽中医药大学药学院陈伟副教授鉴定，样品为木兰科植物五味子的干燥成熟果实。

表1 五味子样品编号及产地信息

1.2 色谱条件

色谱柱：Shim-pack VP-ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本岛津仪器有限公司)，附DAD 检测器；流动相：甲醇-水(体积比为70∶30，下同)溶液，流量为1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：35 ℃；进样体积：10 μL。

1.3 溶液的制备

混合标准溶液：分别精密称取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素对照品适量，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇，超声溶解并定容，混匀，配制成五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的质量浓度均为1.0 mg/mL的混合标准溶液。

系列混合标准工作溶液：分别精密吸取混合标准溶液0.05、0.2、0.5、2、5 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至标线，摇匀，配制成五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的质量浓度均分别为5.0、20.0、50.0、200.0、500.0 μg/mL 的系列混合标准工作溶液。

样品溶液[14]：用1＃样品进行分析条件优化及方法学考察。取过孔径为355 μm (50 目)筛的五味子药材粉末0.25 g，精密称定，置于25 mL 容量瓶中，加入正己烷约18 mL，超声处理(功率为300 W，频率为45 kHz) 30 min，取出，加入正己烷至标线，摇匀，滤过，量取续滤液10 mL 至蒸发皿中，挥干，加入甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，摇匀，过0.45 μm的微孔滤膜。

1.4 实验方法

取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素系列混合标准工作溶液及样品溶液，按1.2色谱条件进样分析，记录色谱峰面积，建立五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的标准工作曲线，计算线性方程，利用标准曲线法计算样品中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量。

2 结果与讨论

2.1 关键分析参数筛选

2.1.1 Plackett-Burman设计

根据文献及预实验，以流动相中甲醇体积分数(φ)、柱温(T)、流动相流量(L)、进样体积(V)为4 个考察因素，五味子醇甲色谱峰与杂质峰的分离度(Y)为关键属性质量[15]。每个影响因素取2 个水平，以高水平(1)和低水平(-1)表示，利用Minitab软件设计12组实验，Plackett-Burman试验设计与结果见表2。

表2 PBD试验方案与结果

2.1.2 PBD试验方案与结果

利用PBD对具有一定风险的因素进行筛选，使用Minitab 软件对表2 数据进行分析[16]。PBD 试验方差分析结果见表3。由表3可知，流动相中甲醇体积分数(φ)和柱温(T)对分离度(Y)有显著性影响(P＜0.05)，其它因素为非关键分析因素。应用CCD-RSM 法对甲醇体积分数(φ)和柱温(T)进一步优化，最终将流动相流量、进样体积分别选择为1.0 mL/min、10 μL。

表3 PBD试验方差分析结果

2.1.3 CCD-RSM优化液相条件

结合上述Plackett-Burman试验结果，发现甲醇体积分数(φ)、柱温(T)对五味子醇甲色谱峰与杂质峰的分离度(Y)的影响较大，故选择φ、T作为考察因素进一步进行液相条件优化。运用Design-Expert 13.0 软件中CCD-RSM 法进行试验设计，每个因素分别设置5个水平：即-1.414、-1、0、1、1.414，选取五味子醇甲的分离度(Y)为评价指标，建立Y与关键质量属性φ、T之间的数学模型[17]，CCD-RSM 试验方案及结果见表4。

表4 CCD-RSM试验方案及响应值

采用Design-Expert 13.0 软件，对表4 数据进行处理，通过统计分析，对分离度进行二次回归拟合，得回归方程：Y=211.227 86-1.137 79φ-9.381 82T+0.015 200φT+0.001 535φ2+0.128 940T2，判别系数R2=0.975 1。其中Y、φ、T分别代表分离度、甲醇体积分数、柱温。表明该模型拟合度较好，能比较准确地分析和预测五味子醇甲的分离条件。

CCD-RSM方差分析结果见表5。由表5可知，φ、T项的P值均小于0.05，表明对Y有显著性影响。失拟项表示所得模型与试验拟合的程度，即二者差异的程度，本实验失拟项的P值为0.114 5，P＞0.05，表明方程模型误差较小，实验条件满足要求。

表5 CCD-RSM方差分析结果

2.1.4 条件优化与预测

利用Design-Expert.13软件求导，可得当流动相中甲醇体积分数为70%、柱温为35 ℃时，分离度为5.932。根据模型分析结果，得最优色谱条件(见1.2)。

2.1.5 验证实验

按照1.2 色谱条件，平行测定3 份样品溶液，测得分离度平均值为5.98。将所得实测值与分离度回归方程预测值进行比较，计算平均偏差为1.05%。偏差较小，表明该模型有效。

2.2 一测多评法建立

2.2.1 一测多评方法学考察

按照1.2 色谱条件，分别精密吸取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素混合标准溶液、样品溶液及加标样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定，色谱图如图1。

图1 高效液相色谱图

(1) 线性关系。在1.2 色谱条件下，分别测定系列混合标准工作溶液，以待测组分的质量浓度(x)为横坐标，以对应的色谱峰面积(y)为纵坐标，进行线性回归，结果见表6。由表6可知，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的质量浓度在5～500 μg/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.999。

表6 五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的线性关系

(2) 稳定性试验。取样品溶液分别于第0、2、8、12、24、36 h进样，记录色谱峰面积，计算测定值的相对标准偏差，结果见表7。

表7 稳定性试验结果

由表7可知，五味子醇甲、五味子甲素和五味乙素的色谱峰面积测定值的相对标准偏差分别为2.3%、2.9%、2.6%，表明样品溶液在36 h 内稳定性良好。

(3) 加标回收与精密度试验。取适量已知含量的序号为1 的五味子药材粉末6 份，各约0.15 g，精密称定，定量加入混合标准溶液1 mL (五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素浓度分别为0.850 1、0.252 1、0.250 8 mg/mL)，按照1.3 方法制备样品溶液，按所建试验方法测定，结果见表8。由表8可知，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的平均加标回收率分别为100.1%、100.6%、100.3%，测定结果的相对标准偏差分别为1.6%、1.8%、1.1%(n=6)。表明该方法的准确度和精密度良好。

表8 加标回收试验结果

2.2.2 相对校正因子的确定

按照1.2 色谱条件，精密吸取混合标准溶液，分别进样1、2、5、10、15、20 μL，测定各成分的色谱峰面积，以五味子醇甲为内标，计算五味子甲素、五味子乙素与五味子醇甲之间的相对校正因子[18‒20]，相对校正因子按照式(1)计算，结果见表9。

表9 两种成分的相对校正因子

式中：fs/i——参照物与目标成分的相对校正因子；

fs——参照物的绝对校正因子；

fi——目标成分的绝对校正因子；

As——参照物色峰面积；

ρs——参照物质量浓度，mg/mL；

Ai——待测成分色谱峰面积；

ρi——待测成分质量浓度，mg/mL。

2.2.3 QAMS法与外标法测定结果比较

取不同批号的药材，分别采用外标法和QAMS法计算五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的量，并将两种方法所得结果进行比较，以验证QAMS 法用于五味子中木脂素类多指成分标含量评价的准确性，结果见表10。由表10 数据可知，采用QAMS 法及外标法所测得的五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的结果基本一致，表明建立的QAMS方法准确、可靠。

表10 五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素测定结果 mg/g

3 结语

建立了测定五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的QAMS法。五味子甲素、五味子乙素与五味子醇甲的相对校正因子重现性良好，QAMS 法与外标法所得结果基本一致，且具有较高的重现性、稳定性及可信度。该方法丰富了五味子药材的质量评价方法，并为QAMS技术在中药质量控制中的推广和应用提供了参考和依据。