MicroRNA-205 通过甲基化修饰调节帕金森病多巴胺神经元LRRK2 表达

王洪伟，陶亮，吕禄廷，孙静慧，张腾腾，李杰，王建东

1.齐齐哈尔医学院附属第二医院神经内科，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院附属第二医院心内科，黑龙江齐齐哈尔 161006

帕金森病（parkinson disease, PD）是中枢神经系统常见的退行性疾病，严重影响老年患者的身体健康[1]。近年来研究表明，遗传因素是PD 发生和发展的重要原因之一，在5%～10%的患者中可以鉴定出一些遗传因素，并且与一般人群或对照组相比，受影响患者的一级家庭成员患该病的风险增加2～3倍[2]。另有研究发现PD 最常见的单基因形式之一是由编码富亮氨酸重复激酶2（Leucinerichrepeatproteinkinase2, LRRK2）的基因突变引起的[3]，特发性PD 的发病机制中发挥作用，LRRK2-PD 和特发性PD 之间的密切相似性提示LRRK2-PD中神经退行性变机制的可能性，这可能为特发性PD 的病理生理学和治疗提供新见解。

MicroRNAs（miRNAs）是进化上保守的小的非蛋白质编码转录本，与靶信使RNA（mRNA）的3'-未翻译区（3'-UTR）的部分互补位点结合，从而调控其靶基因的翻译[4]，许多miRNAs 通过调节靶向基因的翻译与神经系统中的神经元发育、突触可塑性、记忆形成和神经退行性疾病相关[5-6]。目前，虽然有关于miR-205 在神经退行性病变中的相关研究，但其在PD 纹状体中的表达以及对神经元凋亡的影响和机制尚未明确。因此，深入研究miR-205 与LRRK2 在PD 病理改变中的作用及作用机制对于治疗PD 至关重要。本研究通过对PD 细胞模型进行相关实验，探究PD 细胞模型中miR-205 与LRRK2之间的关系，试图通过该实验阐明PD 中miR-205对LRRK2 的调控机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

5%胎牛血清、1%的青霉素/链霉素双抗、高糖DMEM 培养基、细胞培养12 孔板、维生素A、TPA（phorb-ol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate）、MPP（1-methyl-4-phenyl-pyridiniumion）、10%胎牛血清、细胞培养箱、亚硫酸氢盐、甲基化检测试剂盒、miR-205 抑制剂、前体miR-205 及miR-205 阴性质粒、miRNA 提取试剂盒、电泳仪、PCR 仪。

1.2 方法

1.2.1 PD 模型细胞制备 人神经母细胞瘤细胞（SHSY5Y）购买后，采用含5%胎牛血清及1%的青霉素/链霉素双抗在高糖DMEM 中培养进行培养，24 h更换1 次液体，细胞覆盖皿底后用胰酶将其消化为单细胞，并制成1×104/mL 的细胞悬液。然后将细胞以1×104/孔的密度接种到包被明胶的12 孔板中，此时向培养液中添加10 μM 的维生素A，在5%CO2的湿培养箱中37℃条件下培养，48 h 后换液1 次，然后再继续培养24 h。随后，将培养液中的维生素A 替换为80 nM 的TPA，继续培养3 d。SH-SY5Y 细胞诱导分化6 d 后，此时的SH-SY5Y 细胞已经具有多巴胺神经细胞的生物学特征。将分化后的SH-SY5Y细胞分为两组，一组用含5% 胎牛血清的高糖DMEM 培养液培养作为对照组；一组用含1 mM 的MPP 及5%胎牛血清的高糖DMEM 培养液诱导为PD 模型细胞。培养48 h 后，多巴胺神经细胞诱导为PD 模型细胞。

1.2.2 PD 模型细胞中miR-205 甲基化检测 提取SH-SY5Y 细胞的DNA，用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP 扩增产物，确定miR-205 启动子区域的甲基化，并进一步检测miR-205 的转录水平，确定LRRK2 的表达水平。

1.2.3 miR-205 过表达以及抑制试验 购买miR-205抑制剂、前体miR-205 及miR-205 阴性质粒[Ambion（Austin, TX, USA）]，准备进行RNA 干扰及过表达试验，准备12 孔板，复苏SH-SY5Y 细胞，然后将细胞以1×105/孔的密度接种后，用含10%胎牛血清的DMEM 培养液进行培养。细胞培养24 h 后，将其分为4 组：无处理组、阴性对照组、前体miR-205、miR-205 抑制剂。细胞转染48 h 后，收集细胞，分别提取mRNA 进行检测，确定miR-205 水平与LRRK2 表达量之间的关系，明确miR-205 抑制剂在PD 模型细胞的调控机制。

1.2.4 q-PCR 试验 收集细胞，采用试剂盒提取mRNA。miRNA 试剂盒提取组织中总RNA，Qiagen miScript RT 试剂盒进行反转录。再以cDNA 为模板，在DNA 聚合酶作用下扩增合成miR-205 和LRRK2 片段。LRRK2 转录，使用SYBR Green Master mix，GAPDH 作为内源对照，方法参照试剂盒说明书。miR-205 转录水平分析，采用All-in-One™miRNA qRT-PCR Detection Kit 监测试剂盒，U6 作内源对照。PCR 条件：95℃加热40 s；然后95℃加热10 s，60℃延长30 s，总计40 个循环；最后72℃条件下处理5 min。表达量的计算方法采用2-ΔΔCt，ΔΔCt=[Ct（靶基因）-Ct（内参）]组1-[Ct（靶基因）-Ct（内参）]组2。

1.3 观察指标

各组细胞模型中qRT-PCR 检测miR-205、LRRK2 表达水平；使用miR-205 抑制剂后各组细胞模型LRRK2 表达水平；miR-205 过表达后各组细胞模型LRRK2 表达水平

1.4 统计方法

采用GraphPad Prism 软件对数据进行分析，实验的数据以（±s）表示，两组比较采用独立样本t检验，多组比较采用方差分析方法进行分析；方差分析两两比较结果采用Tukey-Kramer 多重比较检验确定统计学意义。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD 模型细胞中miR-205 水平下调，LRRK2 水平上调

本研究提取正常细胞以及PD 模型细胞的总RNA，通过q-PCR 方法检测两种细胞中miR-205 以及LRRK2 的表达水平，发现相较于正常细胞（1.02±0.14），PD 模型细胞中miR-205 的表达水平明显降低（0.59±0.03），差异有统计学意义（P=0.017），见图1A；而相较于正常细胞（1.00±0.11），PD 模型细胞中LRRK2 水平上调（1.50±0.10），差异有统计学意义（P=0.033），见图1B。

图1 miR-205 及LRRK2 表达水平

2.2 miR-205 抑制剂促进LRRK2 表达

miR-205 抑制剂被设计用于特异性结合内源性miR-205 并抑制其活性。经鉴定，相较于正常细胞（1.02±0.11）以及PD 模型细胞（1.47±0.12），转染miR-205 抑制剂后可诱导神经元培养物中LRRK2蛋白表达的剂量依赖性上调（1.87±0.11），差异有统计学意义（P=0.036），见图2。

图2 miR-205 抑制后LRRK2 表达水平

2.3 miR-205 过表达可抑制LRRK2 表达

为了进一步研究miR-205 对LRRK2 表达的影响，将前体miR-205 转染到细胞中，通过q-PCR 分析LRRK2 转录水平。前体miR-205 进入细胞后被转化为成熟miR-205。观察到，相较于正常细胞（1.02±0.11）以及PD 模型细胞（1.47±0.12），使用前体miR-205 处理SH-SY5Y 细胞可持续抑制LRRK2蛋白表达约50%（0.87±0.11），差异有统计学意义（P=0.020），见图3。

图3 miR-205 过表达后LRRK2 表达水平

3 讨论

miR-205 参与代谢、神经营养素信号调节等生物学过程，其异常表达与PD 的发生有关，但其在PD 患者纹状体中的表达以及对神经元凋亡的影响和机制尚未明确[7]。LRRK2 是常染色体遗传性PD最常见的病因。LRRK2 突变导致全球多达5%的家族性病例[8]。LRRK2 的错义突变与家族性和散发性PD 相关。LRRK2 基因表达的简单改变可能导致常见散发性PD 的可能性[9]。LRRK2 酶结构域的7个点突变（G2019S、I2020T、R1441C/G/H、Y1699C、N1437H）导致常染色体显性PD。重要的是，LRRK2的遗传变异体也是克罗恩病、麻风病和结核病的危险因素，这提示LRRK2 蛋白在中枢神经系统之外发挥重要作用，有研究表明LRRK2 蛋白在全身低水平表达，在肾脏、肺和免疫细胞中水平最高，在大脑中有少量表达[10]。此前已有研究尝试检测家族性和散发性PD 患者大脑中LRRK2 蛋白的表达水平[11]。

有研究表明，LRRK2 可能与miRNA 处理途径相互作用，调节蛋白质合成[12]。Chen Q 等[13]研究表明MALAT1/miR-205-5p 轴通过靶向LRRK2 调控MPP+诱导的MN9D 细胞凋亡，Cho HJ 等[14]检测了散发性PD 患者额叶大脑皮层中LRRK2 蛋白和LRRK2 靶向miR-205 的水平。他们发现，LRRK2 蛋白表达水平在PD 患者大脑中显著升高，而miR-205表达水平降低，进一步研究发现miR-205 可以直接调控LRRK2 的表达。并且体外细胞模型也已明确，LRRK2 蛋白的表达水平在PD 组中的表达显著增加[15]，与本文出的结论一致，本研究在PD 模型细胞中也发现LRRK2 蛋白表达水平升高，而miR-205表达水平降低，当过表达miR-205 后，LRRK2 蛋白表达下降；与前期研究结论相似[15]，本研究也进一步证明了miR-205 能抑制LRRRK2 的表达。因此，深入研究miR-205 与LRRK2 在PD 的病理改变中的作用及作用机制对于治疗PD 至关重要，研究miRNA-205 在PD 病理改变中的调控作用对于寻找PD 治疗新靶点具有重要意义。

为了研究PD 患者中miR-205 的过表达或抑制是否影响LRRK2 的表达，本研究使用SH-SY5Y 成功诱导出PD 细胞模型，并对PD 细胞模型进行miR-205 过表达及抑制实验，发现在PD 细胞模型中miR-205 可以抑制LRRK2 的表达，miR-205 的下调可能导致了LRRK2 蛋白在散发性PD 患者脑内的潜在致病性升高，而过表达miR-205 可能为抑制LRRK2 蛋白在PD 中的异常上调提供一种适用的治疗策略，这些结果表明内源性miR-205 是细胞中LRRK2 蛋白表达的抑制因子。本研究推测microRNAs 可能负责LRRK2 的转录调控，因为它们以序列依赖的方式结合到靶基因3'-UTR 的特定区域，从而抑制基因转录，进一步证实了miR-205 在调节LRRK2 表达中的作用。因此，本研究结果表明，miR-205 可能是PD 的潜在生物标志物，上调miR-205 水平可能为抑制散发性PD 中LRRK2 的表达提供一种可能的治疗途径。但是目前尚不清楚miR-205 在PD 患者大脑中的表达是如何下调的。因此进一步研究PD 患者脑内miR-205 基因位点的DNA 甲基化或其他修饰，可能为阐明散发性PD 患者miR-205 表达变化的机制提供线索。

综上所述，本研究进一步揭示了miR-205 调控LRRK2 蛋白表达的新机制，提示miR-205 可能作为散发性PD 的生物标志物和治疗靶点。