附子汤治疗颈椎病的作用机制*

于澜，杨少锋

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410208

2 湖南中医药大学第一附属医院 湖南长沙 410208

颈椎病[1]（Cervical spondylosis）是由于颈椎退行性改变或是周围组织病理改变，影响周围的神经、血管等，导致一系列症状和体征。近些年来，颈椎病的发病率逐年呈递增的趋势。近年来，现代医学对症治疗颈椎病的局限性和不稳定性以及临床治疗模式的转型[2]，在颈椎病的前期治疗及延缓疾病发展过程中，中医药治疗[3]具有整体辨证、使用方便、疗效突出、价格低廉等优势受到广泛认可；但是中医药治疗颈椎病的科学性备受质疑，故因此利用网络药理学技术探究中药复方治疗颈椎病的分子机制具有重要的临床意义。颈椎病在中医中属于“项痹”范畴[4]，气血受到风寒湿阻滞，周围筋肉无以濡养，而出现颈部酸胀痛，伴随眩晕、手部疼痛和麻木，活动欠佳的症状。

附子汤[5]出自《伤寒杂病论》，原文论述为“少阴病，身体痛，手足寒，骨节痛，脉沉者，附子汤主之”，具有温经助阳，祛寒除湿的功效。本课题组[6-9]运用六经辨证在临床上运用经方治疗颈椎病取得了较好的疗效，现代研究也证实[10]附子汤具有抗炎、止痛、调节关节软骨代谢等作用，但是附子汤治疗颈椎病的作用机制还未明确，因此本课题组通过网络药理学进一步预测附子汤的活性化合物及治疗颈椎病的靶点，然后通过分子对接验证，为附子汤治疗颈椎病提供科学理论基础。

资料与方法

1 附子汤中药化学活性成分及作用靶点的挖掘筛选

在TCMSP[11]（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）数据库中以药物口服生物利用度 （oral bioavailability，OB）≥ 30%，药物相似性 （drug likennss，DL）≥ 0.18，作为筛选参数分别检索附子汤的成分“附子、茯苓、人参、白术、芍药”的活性成分。将上述在TCMSP数据库中获得的活性成分按Related Targets获得相应的疾病作用药靶，在UniProt（https：//www.uniprot.org/）数据库，筛选物种为“homo sapiens”的靶点，获得公认的gene symbol。

2 颈椎病疾病靶点收集与筛选

通过GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（http：/www.omim.org/）、DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）、Drugebank（https：//go.drugbank.com/）、CTD[12]数据库。搜索 “cervical myelopathy”或”cervical spondylosis”，获得颈椎病疾病靶点，通过去除重复靶点及将重复靶点在UniProt（https：//www.uniprot.org/）数据库，筛选物种为“homo sapiens”的靶点，获得官方颈椎病疾病靶点。并将附子汤药物的作用靶点与颈椎病疾病靶点上传至Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）获得交集为附子汤治疗颈椎病的潜在作用靶点（核心基因）。

3 KEGG通路和GO富集分析

将上述获的核心基因运用Metascape数据库（http：//metascape.org/gp/index.html）做GO富集分析与KEGG富集分析，FDR ＜ 0.05代表富集结果显著。最后利用R语言绘制 GO 富集分析气泡图及KEGG富集分析气泡图。

4 蛋白质相互作用（PPI）网络构建

将上述获得的核心基因上传至STRING数据库Version11.0（http：//STR-ING-db.org）对蛋白质相互作用关系（protein-proteininteraction，PPI）预测，选择“homo sapiens”的参数，设置互动分数为0.4，隐藏网络中断开连接的节点，获得蛋白质相互作用的数据，在Cytoscape 3.7.1软件中打开蛋白质相互作用数据，节点的大小颜色代表结合分数高低，节点的连线代表结合分数高低，获得PPI图。

5 附子汤作用于颈椎病“药物-活性成分-疾病作用靶点”网络构建

在Excel中建立复方与单味中药、单味中药与活性成分、活性成分与作用靶点、疾病与疾病致病靶点关系数据，利用Cytoscape3.7.1软件打开数据构建“药物-活性成分-疾病作用靶点”网络图，利用Network Analyzsis计算单个节点Degree值。

6 核心分子对接验证

将上述Degree数据进行排序，挑选Degree值位于位于前10的core gene，在PDB（https：//www.rcsb.org/）数据库，选择“homo sapiens”的参数，下载核心蛋白的基因3D结构（.PDB格式）；挑选Degree值位于前10的中药活性成分，在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中，下载活性成分小分子化合物结构（.mol2格式），利用PyMOL软件对蛋白质进行去水、去磷酸根等操作，利用Auto Dock1.5.6软件将化合物及核心蛋白基因pdb格式转为pdbqt格式，最后进行利用Vina进行对接，评估对接binding energy，选取结合能≤ -5.0 kJ/mol 的活性成分作为附子汤治疗颈椎病靶点的筛选依据，并用PyMOL软件建立对接模式图。

结 果

1 复方活性成分筛选结果

通过TCMSP数据库获得活性化合物，剔除无对应靶点的活性成分，共获得38个活性成分，其中白芍8个，白术4个，茯苓6个，附子6个，人参17个。其中白芍和人参活性成分重合β-谷固醇（betasitosterol）、谷甾醇（kaempferol），白芍和附子活性成分重合谷甾醇（sitosterol）。活性成分的基本信息见表1，下表仅列出Degree值前12活性成分。

表1 degree值排名前12的活性成分的基本信息

表2 6个核心靶点蛋白拓扑学性质

2 附子汤药效靶点及预测疾病治疗靶点结果

在TCMSP数据库和BATMAN数据库预测到109个附子汤药物靶标，检索GeneCards、OMIM、Drugebank、DisGeNET、CTD数据库分别检索疾病靶标，剔除重复检索的靶标，上传至Uniport数据库，得到“homo sapiens”。致病靶标976个。

3 附子汤-颈椎病交集靶点Venny图

运用Venny平台，得到附子汤与颈椎病的交集基因16个，见图1。下载交集数据，后续进行GO、KEGG分析。

图1 附子汤-颈椎病Venny

4 KEGG通路和GO富集分析结果

利用Metascape数据库对上述交集潜在作用靶点进行生物信息学分析。该富集分析中，GO条目283个，包括生物过程（biological process，BP）主要是对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应、细胞对药物的反应等；细胞组成（cellular component，CC）涉及膜筏、膜微区等；分子功能（molecular function，MF）涉及蛋白激酶活性、细胞因子受体结合等。根据P＜0.01，分别取排名前20的条目进行可视化分析，见图2。KEGG条目55条，信号通路主要涉及TNF信号通路、IL-17信号通路、c-type lectin receptor信号通路等。

图2 GO富集分析气泡

图3 附子汤交集靶点蛋白PPI网络

图4 药物-活性成分-疾病作用靶点网络

5 PPI网络构建模块

将在Venny平台下载得到的16个交集基因上传到STRING数据库，设置互动分数为0.4，隐藏网络中断开连接的节点，得到蛋白互作PPI网络，网络中有节点16个，线条数53条，平均节点度：6.62，取BetweennessCentrality值＞0.0126012，ClosenessCentrality值＞0.55801105，Degree值＞1倍中位数值7，得到IL6、IL1B、PTGS2、CASP3、CASP1、VCAM1这些靶点可认为是附子汤治疗颈椎病中发挥重要作用。

6 附子汤作用于颈椎病“药物-活性成分-疾病”作用靶点网络构建

利用Cytoscape 3.7.0软件对药物-活性成分-疾病进行网络构建，其中深蓝色倒三角为附子汤，深蓝色三角形为颈椎病，浅蓝色矩形为各药味名称，深红色矩形为药物共用活性成分和疾病致病靶点，其余淡红色矩形代表药物共有活性成分。节点之间连线表明药物-活性成分-疾病之间的靶向关系，连线越多越密集，节点在网络中越占据核心地位。

7 分子对接结果

将附子汤筛选得到的10个核心靶点及核心活性成分进行分子对接，其中核心靶点的基本信息见下表3，横坐标为核心蛋白，纵坐标为核心活性成分作结合能热值图，如图5。分子对接结果中，绝大部分分子结合能＜-5.0 kJ/mol，其中Fumarine、Inermin、Frutinone A、Deltoin、Girinimbin与4个蛋白结合能均＜-5.0 kJ/mol，beta-sitosterol、Stigmasterol除与CASP3外，其余结合能均＜-5.0 kJ/mol，表明这些活性成分与靶点有更佳的结合能力，可能为附子汤作用于颈椎病的关键活性成分。绘制每个活性物质对接最低结合能对接模式图，见图6。

图5 附子汤中活性成分与核心靶点分子对接结合能热

图6 每个结合能最低的活性成分-靶点

讨 论

基于网络药理学和分子对接，探讨附子汤治疗颈椎病的作用机制，从单味中药与靶点匹配结果中发现，丁香酮 A、普罗托品、β-谷甾醇、豆甾醇等能够匹配较多靶点，可能为附子汤治疗颈椎病的关键活性成分，丁香酮A有多种生物活性，包括抗氧化以减弱氧化应激反应，抑制炎症的发生，软骨细胞的凋亡来治疗关节炎；普罗托品[13]通过抑制核因子-κB信号通路，从而减弱促炎酶、细胞因子和趋化因子的表达，导致促炎介质的下调，进而用于关节炎的防治；此外，普罗托品具有抑制脂多糖诱导的细胞凋亡[14]。在免疫系统中起主要作用TOLL样受体4（TLR4）是脂多糖的识别受体，炎症刺激脂多糖TOLL受体后，核因子κB信号通路被激活[15]，并促进炎性细胞因子和化学诱导剂的产生[16]，另外，其减少炎症介质如前列腺素释放，致体内环氧合酶-2含量下调，增加抗炎因子基因表达水平[17]；β-谷甾醇具有抗炎、抑制肿瘤、免疫调节、抗氧化、镇痛、促进伤口愈合等广泛的生物作用[18]，此外，其通过提升机体氧自由基（OFR）的清除能力，促使血清NO含量升高，抑制肿瘤坏死因子（TNF-α）的聚集与释放[19]，例如黄建春[20]等发现豆甾醇能够清除O2和·OH等自由基，并且高浓度的豆甾醇具有明显的抑制效应，具有抗氧化作用；0.3～3mg/kg豆甾醇对明显镇痛作用[21]。

炎症发生细胞因子刺激活性氧的生成[22]，这种活性氧体内水平上调可以促使细胞凋亡，可以激活包括NF-κB的通路、TNF信号通路等多种信号通路[23]。实验证明，NF-κB的通路调节促炎细胞因子转录，导致颈椎退行性病变[24]，当抑制NF-κB活性后，IL-6等炎性因子的表达水平明显降低[25]，干预NF-κB信号通路的下调PAR2可有效延缓炎症的发展[26]。研究表明[27]，在颈椎病患者中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性因子指标显著升高，其通过诱导神经根鞘损伤影响神经传导功能。其次，TNF-α机体水平越高，神经根性疼痛越明显[27]。

分子对接分析提示，PTGS1、PTGS2、CASP3等颈椎病致病的关键靶点，PTGS酶又名环氧合酶，分为两个种类，即结构型的PTGS1和诱导型的PTGS2，能够合成前列腺素[28]，颈椎病的发生发展是由于椎间盘周围组织退行性变，或内外压力失衡，出现椎体周围组织不稳后，导致的创伤性炎症[29]，人体是一个有机整体，长期炎性刺激促使机体代偿性构建椎旁稳定[30]，故椎间盘的退行性变，椎间结构不稳不是引起颈椎病的主要原因，其次与释放的炎性因子有关[31]，PTGS1也被认为在炎症、关节炎和癌症的病理生理过程中起关键作用[32]。研究表明，在炎症介质下，PTGS2的表达上调[33]。CASP3蛋白为天冬氨酸特异酶、半胱氨酸蛋白酶 （Caspases）的家族蛋白，在细胞凋亡中起关键作用[34]，此外，炎症反应和MAPK通路的激活均有CASP3的参与[35]。

综上，附子汤可能是通过影响NF-κB的通路、TNF信号通路来缓解颈椎间盘中的炎症反应，进而对颈椎病有较好的临床效果，然而，本研究是基于有限的生物数据库中收录内容，可能会造成结果的偏倚，此外，分子对接技术是通过计算机模拟技术而实现，因此最终附子汤治疗颈椎病的药物活性成分、靶点、机制等还需要后期可通过体内、体外实验进一步验证，为附子汤治疗颈椎病提供更充分的科学依据。