金黄色葡萄球菌小菌落突变体诱导筛选及特性研究

周宇， 李佳玉， 王乐， 贾晓爽， 高思琦， 王潇， 焦健*

（1.北京城市学院生物医药学部，北京 100094； 2.宁波大学医学院，浙江 宁波 315211）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的人类致病菌，约30%的人群是无症状携带者，60%是间歇性携带者[1]。作为一种重要的人畜致病菌，S. aureus在畜牧业中以引发奶牛乳房炎为主，其比例高达50%以上，产奶量下降20%左右，且治愈率较低，给养殖业造成巨大的经济损失[2]。目前，主要依靠抗生素进行针对性治疗，但在治疗过程中，存活下来的S. aureus会通过代谢途径的改变，形成较难清除的小菌落突变体（small colony variants, SCVs），导致细菌耐药性愈发严重[3]。

SCVs在临床S. aureus感染中发生率约为1%～30%[4]，可诱发人类腹膜炎[5]和假体周围关节感染[6]，甚至会引起血液、骨骼、人工关节、大脑、皮肤、起搏器和囊性纤维化肺感染[7]。SCVs在奶牛乳腺上皮细胞中可持续存在，诱发慢性牛乳房炎疾病，导致久病不愈[8]。目前，通常选择利福平与1种或多种敏感的抗生素联合用药治疗SCVs感染[9]，极大程度上加重了耐药性菌株的出现，给医疗保健系统及畜牧业带来巨大的负担。此外，SCVs具有独特的表型特征和致病特性，如生长缓慢、毒力因子表达量降低、黏附因子表达量提高、类胡萝卜素色素流失、溶血活性降低和凝固酶活性降低等[10-11]，同时形成生物膜的能力、免疫耐受能力[5]及抗生素耐受能力[12]均增强，进而使其在细胞内存活，诱发持续性、复发性感染[13-14]。因此，对于防控此类疾病蔓延、开展SCVs致病机理研究及新型抗SCVs药物研发工作，稳定型SCVs的获得显得至关重要。

目前，获得SCVs常用的方法有低水平抗菌剂诱导法、基因敲除法以及分离鉴定法。低水平抗菌剂诱导筛选法是利用S. aureus最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC， µg·mL-1）筛选具有SCVs特定性状的突变体，如在培养基中添加2×MIC庆大霉素[3]、三氯生[15]、莫西沙星、克林霉素以及利福平等抗菌类药物对金黄色葡萄球菌进行孵育，可筛选得到SCVs[16]。研究表明，利用低水平抗菌剂诱导技术，约5%～10%的菌体可转化为SCVs，诱导筛选得到的SCVs稳定性较高，不易恢复野生表型，并产生耐药性[16]。研究者在利用基因敲除手段获得SCVs相关研究中，发现SCVs的形成与Agr及SigB调控系统中相关基因表达调控有关[4,17-21]。对影响上述调控系统的agr基因敲除，可获得稳定的SCVs菌株[22]，为利用敲除或过表达手段对参与SCVs形成的相关基因编辑，获得稳定型SCVs提供更多思路。除此之外，利用选择分离鉴定方法，在奶牛乳房炎的病变组织中分离鉴定并获得SCVs，在SCVs感染患者的血液、尿液、痰、脓液、耳朵分泌物等样本中也分离得到SCVs，并对其进行测序鉴定[23]。

目前，对S. aureus的SCVs获得方法的研究较少，由于低水平抗生素诱导法获得SCVs的方法较简单，且部分抗生素不仅对金黄色葡萄球菌杀伤能力有限，还能够促进SCVs的形成[24-25]，同时利用低水平抗生素筛选SCVs方法已有报道，为本研究提供了坚实的理论基础，但其筛选得到的SCVs不稳定[3]。因此，本试验将选择利用低质量浓度（1.25～5.00 µg·mL-1）庆大霉素二次诱导野生型S. aureusATCC 43300，旨在获得更稳定的SCVs，并对筛选得到的SCVs菌株进行形态学观察和稳定性及部分特性研究，为探究高效、安全、低耐药、新型针对SCVs药物提供稳定的受试菌株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究中使用的菌株为S. aureusATCC43300。

TSA与TSB培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）用于S. aureusATCC43300和SCVs生长的基本培养基，121 ℃灭菌20 min。

试验所用抗生素为庆大霉素（西典化学科技有限公司），用于对S. aureusATCC43300的诱导及SCVs培养。

1.2 试验方法

1.2.1 低质量浓度庆大霉素诱导获得SCVs方法 参照文献[26]的方法，对S.aureusATCC43300的最小抑菌浓度（MIC）进行测定。首先，挑取S. aureusATCC43300单菌落过夜活化培养，1%转接于TSB培养基中，37 ℃培养4 h至对数生长期，用TSB培养基将其稀释至1×105CFU·mL-1，加入90 µL稀释后的菌液于96孔无菌细胞培养板内。然后，利用二倍梯度稀释法将庆大霉素梯度稀释至不同质量浓度（1 mg·mL-1和500.000、250.000、125.000、62.500、31.250、15.625 µg·mL-1），取10 µL不同质量浓度的庆大霉素分别加入上述96孔培养板，置于37 ℃恒温培养箱静置培养12 h，测定庆大霉素对S. aureusATCC43300的MIC。阴性对照组（PBS）和空白对照组（ddH2O）做相同处理，每组3个重复。同时从上述有抑菌效果的孔中取10 µL培养物涂布于TSA平板上，进一步测定S. aureusATCC43300的最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC，µg·mL-1)。

本试验选用低质量浓度（1.25～5.00 µg·mL-1）庆大霉素二次诱导法获得SCVs。将活化后的S. aureusATCC43300菌液1%转接于含1/2×MIC庆大霉素的TSB培养基中，37 ℃、250 r·min-1振荡培养6 h，取1 mL菌液置于1.5 mL的离心管中，4000 r·min-1离心5 min，弃上清，用 0.3 mLTSB重悬并梯度稀释涂布于TSA培养基中，培养24～48 h。挑取8个较小的单菌落转接于2×MIC庆大霉素（5 µg·mL-1） TSB培养基中，37 ℃、250 r·min-1诱导培养12 h，10倍梯度稀释并涂布于TSA平板上，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，同时将S. aureusATCC43300接种于TSB培养基中作为对照。选取3个SCVs菌株于甘油管中保存菌株。测定庆大霉素对野生型及SCVs的MIC及MBC，方法同上。

1.2.2 SCVs表型分析及生长曲线测定方法 划

线点板及生长曲线测定方法参考文献[27]，将酵母培养的方法替换为S. aureusATCC43300及SCVs培养方法，且生长曲线采样时间稍作变化。具体方法如下：利用划线培养法和稀释点板法观察SCVs表型。划线培养法将S. aureusATCC43300和SCVs分别在TSA平板及含5 µg·mL-1庆大霉素的TSA平板上划线培养48 h，观察菌落生长情况。稀释点板法将S. aureusATCC43300和SCVs过夜活化培养后分别10倍梯度稀释至108、109和106、107。将上述稀释后的菌液分别取5 µL于TSA培养基进行点板。37 ℃培养48 h，观察菌落生长情况。为研究SCVs与野生型菌株生长的快慢，对其生长曲线进行测定。分别将S. aureusATCC43300和SCVs菌液，1%转接至50 mL的TSB培养基中，其中SCVs的TSB培养基中加入5 µg·mL-1庆大霉素，每组3个重复。每隔1 h取样，在紫外分光光度计OD600处测量其光密度值，并绘制生长曲线。

1.2.3 结晶紫染色法验证SCVs形成生物膜的能力 结晶紫染色法测定生物膜的方法参照文献[28]。将培养至对数期的S. aureusATCC43300和SCVs用TSB稀释至OD600为3，每孔200 µL接种于96孔板中，6个重复，并以TSB培养基为空白对照，37 ℃培养24 h。将每孔的上清液用移液枪小心吸弃，PBS溶液将剩余菌液清洗3次，自然晾干后向每孔中加入100 µL的2.5%戊二醛固定，90 min后吸弃固定液，PBS清洗2次。再向每孔加入100 µL的0.1%结晶紫溶液染色15 min，用蒸馏水冲洗掉多余染液，置于室温干燥。最后向每孔中加入200 µL的95%乙醇溶解30 min，用酶标仪在OD570处测量吸光值。通过结晶紫染色法进行鉴定，阴性对照的平均OD600定义为ODc，待测菌株OD与ODc比较，将菌株生物膜形成能力分为4类：阴性（-），OD＜ODc；少量（1+），ODc＜OD≤2 ODc；中量（2+），2 ODc＜OD≤4 ODc；大量（3+），OD＞4 ODc。

1.2.4 恢复突变率测定方法 首先，挑取活化后的SCVs单菌落分别置于TSB培养基和含5 µg·mL-1庆大霉素的TSB培养基中，37 ℃过夜培养，取菌液稀释涂布于不含有庆大霉素的TSA平板中37 ℃过夜培养。观察并记录大小菌落个数，计算SCVs的恢复突变率[3]。然后，将第1代的SCVs经20次传代后，置于含5 µg·mL-1庆大霉素的TSB培养基中，37 ℃过夜培养。培养后，取菌液稀释涂布于不含庆大霉素的TSA平板中37 ℃过夜培养。观察并记录大小菌落个数，计算SCVs经20次传代培养后的恢复突变率。

1.2.5 药敏试验 为探究SCVs对其他广谱类抗菌药物的敏感性，对SCVs及野生型S. aureusATCC43300菌株进行药物敏感性测定[29]。将活化后的野生型S. aureusATCC43300菌液与液体状态下的TSA培养基混合，并将活化后的SCVs菌液与含有5 µg·mL-1庆大霉素的液体状态的TSA培养基混合，均进行倒平板，待凝固后分别将青霉素、氨苄西林、头孢曲松、四环素、红霉素、林可霉素、复方新诺明、氯霉素8种药物的药敏片按顺序贴在含有野生型S. aureusATCC43300及SCVs的TSA平板上。37 ℃过夜培养，观察并记录透明圈大小。

1.2.6 凝血试验 为观察其凝血快慢，分别取100 µL活化后的SCVs与野生型S. aureusATCC43300菌液于1.5 mL离心管中，向菌液中加入400 µL含柠檬酸钠（3.2%）的人血，吹吸混匀后置于37 ℃培养箱中孵育，前4 h每30 min观察1次，然后每隔2 h观察1次，观察并记录凝块时间[30]。

1.2.7 胁迫试验 为验证SCVs在极端情况下的存活率，分别对SCVs和S. aureusATCC43300进行高渗透压胁迫分析试验[31]。将S. aureusATCC43300与SCVs分别培养至对数期，分装为500 µL·支-1，各分装4支离心管，3000 r·min-1离心5 min，弃上清，将沉淀分别重悬于500 µL无菌25%、30%、35%及对照0.9%的NaCl溶液中，室温静置1 h，3000 r·min-1离心5 min，弃上清，并用500 µL无菌0.9% NaCl溶液重悬，进行梯度稀释涂平板，37 ℃过夜培养，对菌落进行计数。将上述计算得到的菌落数按照如下公式计算S. aureusATCC43300与SCVs的存活率。

1.2.8 SCVs相关特性基因表达 挑取活化后的S. aureusATCC43300和SCVs单菌落于TSB及含5 µg·mL-1庆大霉素的TSB培养基中过夜培养，1%转接培养至对数期，并稀释到1×108CFU·mL-1，按RNAprep Pure细菌总RNA提取试剂盒(DP430)说明书提取RNA，再将RNA反转录成cDNA作为荧光定量PCR的模板，按ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书进行操作。以S. aureusATCC43300为对照与SCVs中Agr及SigB调控系统和毒力基因及生物膜相关基因表达情况进行对比分析。引物如表1所示。

表1 Agr及SigB调控系统中相关基因的扩增引物［32-37］Table 1 Amplification primers of Agr and SigB regulatory system genes［32-37］

2 结果与分析

2.1 低质量浓度庆大霉素诱导获得SCVs分析

利用低质量浓度抗生素诱导法获得SCVs，首先对S. aureusATCC43300的MIC进行测定，由表2所示，庆大霉素对S. aureusATCC43300的MIC为2.5 µg·mL-1。

表2 MIC和MBC的测定Table 2 Determination of MIC and MBC

然后，在含1/2×MIC庆大霉素TSB培养基中对S. aureusATCC43300进行诱导，筛选得到SCVs。在TSA平板上，未诱导的对照组菌落大小均匀、大而突起、不透明、圆形、表面光滑，与对照组相比，经1/2×MIC庆大霉素诱导的S. aureusATCC43300，菌落生长大小不均匀，出现明显较小的菌落（图1A）。选取8个较小的单菌落，转接至含2×MIC庆大霉素TSB培养基再次诱导培养并涂布于TSA平板。与未诱导的S. aureusATCC43300相比，筛选到表型均一、较小且生长缓慢的SCVs（图1B），且庆大霉素对SCVs的MIC及MBC均是野生型的5倍（表2）。

图1 低质量浓度庆大霉素对SCVs的筛选Fig. 1 Screening of SCVs with gentamicin at low mass concentration

2.2 SCVs表型及生长曲线测定分析

为进一步验证SCVs表型的稳定性，通过划线法和点板法在TSA和含5 µg·mL-1庆大霉素的TSA平板上观察SCVs与S. aureusATCC43300的生长情况（图2），在TSA平板上，S. aureusATCC43300与SCVs均生长，而在含5 µg·mL-1庆大霉素的TSA平板上，S. aureusATCC43300不生长，SCVs可以正常生长，且SCVs与S. aureusATCC43300相比菌落较小、细胞数较少，与图1结果一致。

图2 SCVs表型的鉴定Fig. 2 Identification of SCVs phenotypes

由于SCVs菌体比S. aureusATCC43300小，为进一步验证SCVs生长情况，对其生长曲线进行测定。由图3可知，SCVs生长速度较慢，需培养至7 h后才可达到对数生长期，菌落数可达5×108CFU·mL-1，与S. aureusATCC43300培养至对数期时菌落数一致。

图3 SCVs生长曲线的测定Fig. 3 Determination of SCVs growth curve

2.3 结晶紫染色法验证SCVs形成生物膜的能力分析

利用结晶紫染色对SCVs和S. aureusATCC43300进行产生物膜能力测定，结果如表3所示，SCVs产生物膜能力较强，在波长570 nm处其产生物膜能力是S. aureusATCC43300的2倍以上。

表3 结晶紫法鉴定形成生物膜能力Table 3 Identification of biofilm forming ability of crystal violet staining

2.4 SCVs恢复突变率分析

为进一步验证SCVs的稳定性，对SCVs恢复突变率进行统计。将SCVs在含5 µg·mL-1庆大霉素的TSB培养基中过夜培养转接至TSA平板培养，其恢复突变率为0%；而SCVs在无抗性的TSB培养基中培养后转接至TSA平板上过夜培养，菌株发生了恢复突变，其恢复突变率为30%。经过20次传代后，SCVs在无抗性的TSB培养基中培养后转接至TSA平板过夜培养，其恢复突变率为0%。

2.5 药敏试验分析

培养12 h后，SCVs抑菌圈不明显，但仍可测量出此时抑菌圈大小，野生型S. aureusATCC43300抑菌圈清晰可见。培养24 h后，SCVs与野生型S. aureusATCC43300抑菌圈均清晰可见，且经测量发现SCVs抑菌圈直径与12 h时相同。SCVs及野生型S. aureusATCC43300药敏试验结果(表4)显示，SCVs对红霉素不敏感，对头孢曲松轻微敏感。

表4 小菌落突变体与野生型S. aureus ATCC43300药敏试验Table 4 SCVs and S. aureus ATCC43300 drug susceptibility test

2.6 凝血试验分析

在3.2%柠檬酸钠抗凝的血浆样品中，野生型S. aureusATCC43300形成凝块的时间是SCVs的5.5倍，其中，S. aureusATCC43300和SCVs形成凝块的时间分别为4和22 h。

2.7 胁迫试验分析

SCVs和野生型S. aureusATCC43300在高渗透压胁迫下的存活率如表5所示，在25% NaCl溶液胁迫下，S. aureusATCC43300和SCVs的存活率分别为58%和57%；30% NaCl溶液胁迫下，S. aureusATCC43300和SCVs的存活率分别为11%和38%；35% NaCl溶液胁迫下，S. aureusATCC43300和SCVs的存活率分别为10%和31%。盐胁迫试验表明，随NaCl含量的升高，S. aureusATCC43300与SCVs存活率均降低，但在30%和35%的NaCl溶液中SCVs的存活率明显高于S. aureusATCC43300。

表5 高渗透压下野生型S. aureus ATCC43300与SCVs的存活率Table 5 Survival rate of S. aureus ATCC43300 and SCVs under high osmotic pressure（%）

2.8 SCVs相关特性基因表达分析

利用荧光定量PCR方法，对SCVs及野生型S. aureusATCC43300菌株中Agr及SigB调控系统和毒力基因及生物膜相关基因表达情况进行分析。结果表明，在形成SCVs后，Agr调控系统中相关基因呈下调趋势（图4A），其中agrA、agrC、RNAIII转录水平分别下调至野生型S. aureusATCC43300的39%、27%和26%，agrB和agrD转录水平分别下调至0.04%和0.02%；而SigB调控系统中相关基因（sigB、rsbV、rsbU、rsbW）上调0.6～1.2倍（图4B）；图4C结果显示，除sarA外，形成生物膜基因呈上调趋势，其中clfA表达量上调27.7倍，sarA下调至39%，relQ、relP、rsh、luxS、ccp、icaD、eno基因表达量是野生型菌株的1.0～5.4倍，上述结果表明所筛选的SCVs为胸苷突变体；同时，SCVs毒力水平下降（图4D），其中，毒力基因spa下调至0.4%，pvl及hla表达量分别下调至35.0%和2.8%。

图4 SCVs特性基因相对表达Fig. 4 Relative expression of characteristic genes in SCVs

3 讨论

S.aureus是引起医疗和畜牧业获得性感染的主要致病菌之一，在营养缺失、活性氧、低pH及抗菌药物作用等应激环境下可形成SCVs[38]。通常，抗生素可有效杀死SCVs，但持续用药会降低膜电位，从而限制氨基糖苷（如庆大霉素）的摄取，诱发慢性、持续性和复发性感染，并加重细菌耐药性，为根治此类疾病带来困难[39-40]。现有的筛选方法具有筛选时间长、表型不稳定、恢复突变率高、基因敲除困难等弊端，给SCVs致病机制的研究及抗SCVs药物的研发带来难题。因此，稳定型SCVs方法的建立，为探究高效、安全、低耐药、新型针对金黄色葡萄球菌SCVs药物提供稳定的生物学材料。

SCVs的形成均受Agr及SigB调控途径影响[38]，Agr及SigB调控系统分别在SCVs定植阶段、入侵阶段及应激反应中发挥重要作用，同时提高其黏附及产生物膜能力，降低毒力基因表达，保持其定植状态，形成稳定型SCVs。本试验利用荧光定量PCR方法证实，SCVs中agrA和agrC转录水平分别下调至野生型S. aureusATCC43300的39%和27%，agrB和agrD转录水平分别下调至0.04%和0.02%，Agr调控系统相关基因呈下调趋势致使下游RNAIII表达量下降至26%，达到其稳定定植的目的。而SigB作为革兰氏阳性菌的主要压力应答因子，在应激状态下感知环境变化，调节菌体基因表达，抑制毒力基因表达，诱发表型转换，形成SCVs[18-20]。本试验结果再次验证，SigB调控系统中相关基因（sigB、rsbV、rsbU、rsbW）上调（0.6～1.2倍），可有效下调免疫原性毒力因子，抑制毒力基因spa、pvl及hla的表达。同时，产生物膜能力的提高对SCVs复发性感染密切相关，通过上调ica相关因子可增加产膜能力，与本结果一致[41]。因此，利用低水平庆大霉素诱导法筛选得到的SCVs，具有菌落较小、生长缓慢、产生物膜能力增强、毒力因子下调、Agr调控系统相关因子下调、SigB调控系统中基因上调、除sarA外形成生物膜基因呈上调趋势、表型稳定的特性，上述结果与已有结果一致[42-43]。

同时，由sarA下调推测所筛选的SCVs为胸苷突变体[25]，或仅通过调控途径降低致病菌毒力，使其达到长期定植的目的。S. aureus对庆大霉素的摄取取决于膜电位，当电子传递链中的电子流受损时，膜电位会大大降低，限制了质子在细胞膜上梯度的建立，这不仅导致氨基糖苷类物质的摄取减少，还出现无法利用大多数糖类和乳酸的现象，最终导致菌体生长变慢，出现小菌落，逃避宿主免疫反应[44]。然而，在缺乏抗生素选择压力的情况下，SCVs表型可能存在不稳定的现象，伴随氨基糖苷类耐药性的丧失，进而恢复到野生型菌落表型[1]。Martin等[3]利用低水平庆大霉素诱导技术获得点突变的SCVs，在非抗生素压力条件下其恢复突变率高达80%，其中，15个SCVs中有12个菌株可恢复至野生型表型，其余未恢复突变的3个菌株均为片段缺失的菌株。为解决恢复突变率高的问题，本研究采用二次诱导法获得SCVs，经1/2×MIC及2×MIC庆大霉素分别诱导6和12 h，可获得SCVs，在5 µg·mL-1庆大霉素培养条件下可维持稳定的表型，其恢复突变率为0%，然而在非抗生素压力条件下，有30%的恢复突变率。为进一步提升其稳定性，降低恢复突变率，在5 µg·mL-1庆大霉素培养条件下连续传代20次，在非抗生素压力条件下，其恢复突变率为0%。为了维持其稳定性，后续药敏、凝血、胁迫及荧光定量PCR试验仍加入庆大霉素维持其稳定表型。基于以上结果，推测所筛选的SCVs为胸苷突变体，并受Agr及SigB调控系统中相关调控途径影响。后续将进一步验证，同时增加恢复突变的筛选数量，得到片段缺失的无需抗生素环境培养的更为稳定的SCVs。

目前，除利用低浓度抗诱导法获得SCVs外，常用的SCVs获得方法还有基因敲除技术和分离筛选鉴定技术。利用敲除法获得的SCVs表型稳定，不产生恢复突变的SCVs，并可进一步探究其致病机制[22,45]。但与基因敲除法相比，利用低水平庆大霉素诱导技术获得的SCVs虽然在非抗生素压力条件下存在不稳定的现象，但低剂量添加抗生素维持其稳定表型对新药研发影响极小。此外，从首次诱导到成功筛选稳定型SCVs仅需3 d，而利用基因敲除手段获得SCVs用时较长，且成功率较低，存在风险。另外，与临床样本中分离鉴定法相比，低浓度抗诱导法较为安全，且具有操作简单、无需采集病理样本及16S rRNA测序诊断等优点[23,46]。因此，本研究利用低水平庆大霉素二次诱导方法获得SCVs，具有操作简单，耗时较短，表型稳定，特性明确等优点，为SCVs获得提供新方法，同时为新型药物在持续性、复发性SCVs感染防治研究中提供稳定的生物学材料。