植物表皮蜡质合成、运输及调控机制研究进展

李 莉 赵米贤 王建华 刘三震 王国英 SCHNABLE S.Patrick

(1.中国农业大学 农学院/种子科学与技术研究中心/北京市作物遗传育种重点实验室,北京 100193;2.美国堪萨斯州立大学 植物病理学院,美国 曼哈顿 66506;3.中国农业科学院 作物科学研究所,北京 100193;4.美国爱荷华州立大学 农学院,美国 埃姆斯 50011)

植物表皮角质层是所有陆生植物与空气接触部位的一层疏水性屏障,可以控制水在表皮细胞外的细胞壁与大气之间的流动[1]。角质层由表皮细胞产生的角质和表皮蜡质所组成[2]。植物表皮蜡质呈灰白色、霜状,能有效减少非气孔性失水效率,从而提高植株的耐旱性,其突变体表现为表皮蜡质缺失,喷水后,叶片表面容易挂水珠,同等种植条件下表皮蜡质覆盖较多的材料与蜡质缺失突变体相比,非气孔性失水较少,耐旱性较强[3];植物表皮的角质是由ω端中链羟基、C16和C18脂肪酸和甘油组成的核心聚合物。植物角质层蜡质又可分为内表皮和外表皮蜡质,内表皮蜡质通常在角质层形成过程中填充在其致密的网状结构内,而外表皮蜡质堆积在角质层最外层并且组装成各种形态(杆、柱、管、丝、片和颗粒状等)的蜡质晶体[2-3]。表皮蜡质是由超长链脂肪酸及其衍生物、三萜类化合物和一些次生代谢产物(例如,甾醇和类黄酮)共同组成的复杂混合物[4]。大多数蜡质组分为醛、烷烃、次级醇和酮,是在烷烃形成途径中合成的;少数由酰基还原途径形成,拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)中酰基还原途径产生的蜡质占总蜡质质量的10%～15%[5]。蜡质的成分和含量可以根据物种、个体发育和环境的变化而变化[6]。表皮蜡质除了在控制水分散失方面发挥着重要作用,还具有提高耐旱性、减弱紫外光伤害、维持植物表面清洁、抵抗细菌和真菌病原体伤害等功能[7-8],已有研究表明蜡质在植物抵御昆虫的相互作用中也扮演着重要角色[9]。

玉米苗期耐旱能力较好,其叶片表面角质层蜡质较丰富。而通常随着幼苗的发育,叶片表皮毛细胞逐渐伸长,毛状体的表皮毛细胞逐渐在植物发育成熟后,对叶片水分保持起到重要的作用[10]。而玉米植株从蜡质依赖型的幼苗期向成株期转换过程中,Glossy15起到了重要的作用[11]。除此之外,大量研究报道植物表皮蜡质不仅具有保水防止植株体内水分散失的功能,表皮蜡质作为一种重要的脂溶性次生代谢产物,对玉米苗期抵御病虫害、低温胁迫及紫外线防护方面有着重要的作用[7]。因此,研究植物表皮蜡质对植物抵御逆境为害具有重要的意义。

植物表皮蜡质的合成与运输过程十分复杂,参与这一过程的基因也有很多[5,12]。目前,对具体基因在细胞学、分子生物学以及生理生化水平的综合分析鲜见报道。本研究通过整理1974—2022年玉米及拟南芥中蜡质合成和运输的相关文献,综合分析了植物表皮蜡质生物合成和运输的过程及调控机制,旨在阐明植物蜡质合成、转运的分子机制及调控网络,以期为作物抗旱育种提供参考。

1 文献来源

依据PubMed,Web of Science和中国知网数据库,以“表皮蜡质”(“Epicuticular wax”)及“植物”(“Plant”)为关键词检索到1974—2022年中、英文相关文文献报道125篇。

2 植物蜡质合成途径与机制

基于目前对拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)、玉米(ZeamaysL.)、水稻(OryzasativaL.)蜡质合成的研究(表1、表2和表3),蜡质合成的基本途径主要分为3步:脂肪酸的从头合成、超长链脂肪酸的合成以及蜡质各组分的合成。蜡质成分的合成又分为脱羧和酰基还原2个途径,其中脱羧途径又被称为烷烃合成途径,而酰基合成途径又被称为醇合成途径。脱羧途径主要合成醛、烷烃、次级醇和酮等;酰基还原途径主要合成初级醇和蜡酯。

表1 拟南芥基因组中参与蜡质合成、运输及调控的相关基因Table 1 Genes related to wax synthesis,transport and regulation in Arabidopsis thaliana genome

表2 玉米基因组中参与蜡质合成运输及调控的相关基因Table 2 Genes related to wax synthesis,transport and regulation in maize genome

表3 水稻基因组中与蜡质合成运输及调控的相关基因Table 3 Genes related to wax synthesis,transport and regulation in rice genome

2.1 脂肪酸的从头合成

脂肪酸的从头合成主要分为两步:第一步是将脂肪酸的合成原料—乙酰辅酶A从线粒体基质转运到细胞质中。在线粒体基质中的乙酰辅酶A和草酰乙酸结合生成柠檬酸,柠檬酸通过线粒体内膜上的载体进入细胞质中,在柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)的作用下,分解成乙酰辅酶A和草酰乙酸,草酰乙酸在苹果酸脱氢酶和苹果酸酶的作用下,通过线粒体内膜上的载体回到线粒体基质,进而实现了乙酰辅酶A从线粒体基质向细胞质的转运[99]。第二步是乙酰辅酶A在脂肪酸合成酶复合物(fatty acid synthase complex,FAS)的催化下,生成C16或C18脂肪酸,见图1。乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶的作用下,生成丙二酸单酰辅酶A,再经过由β-酮酯酰-ACP合酶催化的缩合反应,由β-酮酯酰-ACP还原酶催化的还原反应,由β-羟酯酰-ACP脱水酶催化的脱水反应,由烯酯酰-ACP还原酶催化的还原反应,最终生成产物丁酰-ACP,由此完成一次循环,脂肪酸链增加了2个C原子。经过7或8个循环生成C16、C18酰基-ACP,再由酰基-ACP硫酯酶(fatty acy1-ACP thioesterases,FAT)催化形成C16、C18脂肪酸[13,99-100]。具有FAT活性的基因有FATA和FATB,FATA对18:1-ACP的底物活性较高,对饱和酰基-ACP底物的活性较低,而FATB对饱和的酰基-ACP底物活性高[99]。FATB是饱和脂肪酸合成的关键酶,而饱和脂肪酸对于植物表皮蜡质主要成分中超长链饱和脂肪酸的衍生物(烃、醛、酮、伯醇、仲醇、酯等)、萜类等的蜡质生物合成、以及调节植物生长和种子发育都具有重要作用[99-100,13-14]。

NADH+H+,还原性辅酶I;NAD+,辅酶I;ATP,三磷酸腺苷;ADP+Pi,二磷酸腺苷+游离磷酸基团;ACP,酰基载体蛋白;FatA/FatB脂肪酸ACP硫酯酶,酰基-ACP硫酯酶。NADH+H+,reduced coenzyme I;NAD+,coenzyme I;ATP,adenosine triphosphate;ADP+Pi,adenosine diphosphate+phosphate radical;ACP,acyl carrier protein;FatA/FatB,fatty acy1-ACP thioesterases A or fatty acy1-ACP thioesterases B.

2.2 超长链脂肪酸(VLCFAs)合成

C16、C18脂肪酸在长链酰基辅酶A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase,LACS)的催化下形成相应的酰基辅酶A,再转移到内质网上,见图2。Lv等[15]研究发现,拟南芥突变体lacs1/cer8的茎和叶表皮的蜡质总量减少,C29烷烃的含量明显减少,C26—C30自由脂肪酸含量增加,同时发现突变体C16角质单体含量下降,C18角质单体含量增加,这说明,LACS1/CER8基因不仅与植物表皮蜡质合成有关,在角质的合成中也发挥作用。Weng等[16]发现,拟南芥突变体lacs2的角质含量显著降低但蜡质含量无显著变化,而在lacs1/lacs2双突变体中烷烃、次级醇、酮等含量显著减少,这表明了LACS2具有增强LACS1蜡质合成的功能。拟南芥LACS3也参与植物表皮蜡质的生物合成,LACS3在体内具有很高的酰基CoA合成酶活性,且在酵母中表达时能够增加长链脂肪酸的含量[17]。LACS4与LACS1在蜡质合成中具有累加效应,其双突变体中蜡质组分醛、烷烃等含量显著低于单突变体中的含量[18]。

KCS,β/3-酮脂酰-CoA合成酶;KCR,β/3-酮脂酰-CoA还原酶;HCD,β/3-酮脂酰-CoA脱水酶;ECR,反式-2-烯酯酰-CoA还原酶;Ald,醛类;alc,醇类;1°alc,伯醇;2°alc,仲醇;alk,烷烃;ket,酮类;FAE,脂肪酸延伸酶复合体。KCS,β/3-Ketoacyl-CoA synthase;KCR,β/3-ketoacyl-CoA reductases;HCD,β/3-hydroxyacyl-CoA dehydratases;ECR,trans-2-enoyl-CoA reductases;Ald,aldehydes;alc,alcohol;1°alc,primary alcohol;2°alc,secondary alcohol;alk,alkene;ket,ketone;FAE,fatty acid extension enzyme complex.

C16、C18脂肪酸辅酶A形成的超长链脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFAs)是蜡质合成的直接前体物质。VLCFAs是在植物表皮细胞的内质网中由脂肪酸延伸酶(multienzyme fatty acid elongase,FAE)复合体催化形成。FAE复合体主要包含4种酶,分别为β-酮脂酰辅酶A合成酶(β-ketoacyl-CoA synthase,KCS)、β-酮酰基辅酶A还原酶(β-ketoacyl-CoA reductase,KCR)、β-羟酰基辅酶A水解酶(β-hydroxyacyl-CoA dehydratase,HCD)和烯酰辅酶A还原酶(enoyl-CoA reductase,ECR),在这4种酶的催化下,经过多个循环反应,C16或C18脂肪酸被延伸成为具有足够碳链长度(20～34个C)的VLCFAs[101-103]。其中,KCS具有严格的底物特异性,它的类型决定了循环反应的速度和最终得到的酰基辅酶A产物的长度。除此之外,脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)是多不饱和脂肪酸合成途径中的关键酶,它控制着多不饱和脂肪酸的不饱和程度,其脱氢作用也能直接影响到植物表皮脂肪酸的合成和蜡质积累[54]。

Costaglioli等[104]通过转录组分析在拟南芥基因中鉴定出21个KCS基因,且已有8个KCS基因被证明可编码能够催化 VLCFA 形成的蛋白[19,104]。有研究表明,KCS1基因突变导致拟南芥叶片表皮蜡质C26～C30醇和醛含量显著减少,但C29烷烃和C29酮含量无显著变化[19]。KCS2/DAISY和KCS20的序列高度相似,主要参与脂肪酸的链长从C20延长至C22的过程,在缺水或渗透胁迫条件下,KCS2/DAISY的表达要高于KCS20[21]。KCS5/CER60可以利用C22作为底物,将脂肪酸链延长至C28[101]。KCS6/CER6编码超长链脂肪酸缩合酶,是负责将VLCFA延伸至C34的关键酶,从而导致植株茎表皮蜡质含量极显著减少,在相对湿度较低的条件下还表现出部分雄性不育[22-23,105]。已有报道在拟南芥中KCS5和KCS6表现为功能冗余[24-25]。此外,玉米的Glossy4和拟南芥的CUT1基因编码蛋白同源,编码1种缩合酶,参与VLCFA的延伸[106]。拟南芥KCS9参与C22至C24脂肪酸的延伸,这些脂肪酸是角质层蜡质生物合成的重要前体[26-27]。Hegebarth等[28]研究发现,KCS10/FDH基因编码与KCS有关的蛋白质,该蛋白质可能与长链脂质分子的合成有关,表明KCS10/FDH可能参与蜡质和角质层的形成。拟南芥KCS16主要参与C34—C36(C38)的延长,其突变会造成C36脂肪酸含量显著减少[28]。KCS18/FAE1在拟南芥发育的种子中特异表达,主要调控脂肪酸碳链长度从C18—C20(C22)的延伸,提高蓖麻种子中油酸的含量[31,107-108]。在玉米(Zeamays)中发现的Glossy8基因编码β-酮酰基-CoA还原酶(KCR),Glossy8突变会导致玉米幼苗叶片上蜡质含量显著减少[109]。Dietrich等[110]进一步发现了2个与GLOSSY8蛋白序列相似度高达97%的同源旁系蛋白GLOSSY8A和GLOSSY8B,这两个同源基因双突变体在胚胎发育过程中致死,其在影响蜡质合成的功能上也和Glossy8相同。在水稻中发现,WSL1编码KCS家族蛋白,WSL1的突变体叶片和叶鞘上的蜡质显著减少,WSL1能催化C20—C24VLCFAs的延伸,进而影响水稻幼苗期叶片及植株生长发育过程[93]。

KCR在植物形态建成过程中是非常重要的[111]。具有KCR酶活性的KCR1和KCR2,在拟南芥中能够导致植物表皮蜡质含量减少并且影响超长链脂肪酸化合物的合成[32]。KCR1和KCR2在拟南芥的角果、花、茎、叶以及正在发育的胚胎中都有表达,但只有KCR1能够在根中表达。在水稻中发现的WSL3基因编码KCR,且与拟南芥AtKCR1基因和酵母YBR159w基因编码蛋白相似,并通过参与VLCFA的延伸影响水稻叶片蜡质的生成[20]。拟南芥AKR2A基因的PES基序与KCS1的跨膜基序在质体内相互作用,可通过增加VLCFA的含量提高植株的耐寒性[112]。拟南芥PAS2基因具有HCD活性,PAS2突变体会导致种子中贮存的三酰甘油酯、表皮蜡质、鞘脂类化合物等含量减少[34]。Yu等[48]研究发现,拟南芥CER10编码烯酰辅酶A还原酶(Enyl-CoA reductase,ECR),负责超长链脂肪酸(VLCFAs)的延伸反应,随后衍生成角质层蜡、储存脂质和鞘脂质等[48,113]。在CER10突变体中,总蜡含量显著减少,其中茎表皮蜡质含量减少了60%。

在拟南芥CER2突变体中,所有蜡质组分都减少,特别表现为超过28个碳原子的蜡质组分含量显著减少。Haslam等[43]进一步研究发现CER2属于乙酰辅酶A依赖型酰基转移酶BAHD超家族成员(BAHD superfamily of acyl-CoA-dependent acyltransferases),参与不同底物的酰基化反应,产生多种次生代谢产物。后来发现的CER2同源基因CER2-like1表明CER2是参与C28—C30VLCFA酰基链的延伸,而CER2-like1则是参与C30—C32VLCFA酰基链的延伸反应[52-53]。此后,在拟南芥中发现的CER26基因,与CER2具有较高的相似性,主要负责C30及以上脂肪酸链的延伸,其在叶片蜡质合成上与CER2具有同样的功能[44]。Alexander等[87]在玉米中也发现了CER2的同源基因Glossy2和Glossy2-like基因,他们都是BAHD超家族的酰基转移酶的成员,与拟南芥CER2基因的序列非常相似,Glossy2和Glossy2-like在功能上可与拟南芥CER2突变互补,对植物的表皮脂质和脂质组成有不同的影响,主要影响C32的烷基链酰基脂质,但Glossy2和Glossy2-like基因在影响表皮脂质的功能上具有功能冗余现象。

2.3 酰基还原途径

VLCFAs酰基辅酶A在依赖于NADH的酰基辅酶A还原酶(fatty acyl-CoA reductase,FAR)的作用下将脂肪酸催化合成初级醇(伯醇),每次循环由丙二酰辅酶A提供2个碳原子。初级醇与饱和脂肪酸在蜡质合成酶(wax synthesis,WS)的催化下,缩合生成蜡酯,该途径合成的蜡质占整个总蜡的20%左右,见图3。目前在拟南芥中发现了1个编码FAR的基因FAR3/CER4,其编码1种催化醇形成过程中的脂肪酰基辅酶A还原酶(FAR)。据报道该酶负责在表皮和根中初级醇的合成,说明该基因在超长链初级醇的形成中具有非常重要的作用[4]。进一步分析拟南芥CER4突变体的茎秆蜡成分,发现蜡质的脂肪酸链为C16,C16是拟南芥茎表皮蜡质中蜡酯(wax ester)合成的酰基底物[47]。Li等[49]研究表明,WSD1(wax ester synthase/acyl-CoA:diacylglycerol acyltransferase)是蜡质合成酶/甘油二酯酰基转移酶(wax ester synthase/Glyceryl diester acyltransferase,WS/DGAT)双功能基因家族成员,在拟南芥茎秆的蜡酯合成中起了非常重要的作用。WSD1的突变体中,茎表皮蜡质中蜡酯含量显著减少,并且在大肠杆菌与酵母中表达WSD1基因,蜡酯含量显著增加,表明WSD1主要参与蜡酯的合成。

图3 表皮蜡质主要成分合成途径Fig.3 Synthesis pathway of main components of epidermal wax

2.4 脱羧途径

VLCFAs在酯酰辅酶还原酶(FAR)的催化下生成醛类物质,后在醛脱羧酶(aldehyde decarboxylase,AD)的作用下直接脱羧生成奇数碳原子的烷烃,并释放一氧化碳。烷烃是拟南芥中茎秆蜡的主要组成成分。烷烃在中链烷烃羟化酶(mid-chain alkane hydroxylase,MAH)的作用下羟化生成次级醇(仲醇),次级醇经过醇氧化酶催化生成酮,通过此途径合成的蜡质占植株总蜡的80%左右[55]。目前,有关调控植物蜡质中烷烃合成的基因研究较多。CER1是在拟南芥中发现的第一个蜡质合成基因,其编码醛脱羧酶(AD),负责把超长链醛转化为超长链烷烃[36]。CER1突变体的茎表皮蜡质成分中的烷烃、次级醇和酮含量下降,而醛含量上升。在相对湿度较低的情况下表现出雄性不育;过表达CER1的转基因植株中奇数碳原子烷烃(主要是C29和C31)的含量显著增加,可显著提高植物的抗逆性[37]。后又有研究发现了负责角质超长链烷烃复合体形成的CER1-LIKE1[40]。从拟南芥中克隆出的WAX2基因编码1个约632个氨基酸的膜蛋白,同时影响角质层和表皮蜡质的结构和组成。WAX2突变会导致醛、烷烃、次级醇、酮的比例减少,初级醇和蜡酯的含量增加以及花器官的融合,在相对湿度较低的条件下育性降低,表皮渗透性增加[51]。拟南芥CER3基因是WAX2/YRE/FLP1的等位基因,也参与蜡质和角质的生物合成[45]。Bernard等[38]研究发现拟南芥CYTB5s(cytochrome b5 isoforms)是CER1特殊的辅酶因子,可以提高CER1的活性,从而增加烷烃的生成。CER1与CER3和CYTB5s互作催化超长链酰基辅酶A合成超长链烷烃,CER1与CER3是VLCFAs合成烷烃的核心组件,CER3编码一个超家族脂肪酸羟化酶蛋白,起还原酶作用,而CER1则具有醛脱羧酶活性[38]。玉米Glossy1(gl1)和拟南芥CER3/WAX2编码蛋白同源,它不仅影响角质层蜡质的合成而且对植物表皮发育有多重效应,会改变毛状体的大小以及影响角质的结构[52]。水稻中也克隆出1个与拟南芥CER3/WAX2和玉米GL1同源的基因WSL2,水稻WSL2突变体能够显著减少C22～C32脂肪酸的含量[53]。在玉米的蜡质合成突变体Glossy11中,超长链醛合成过程完全受阻,烷基酯的含量明显增加,尤其是链长为C40～C48的分子。此外,该突变体蜡质成分中的正丁醇(C32烷醇)含量降低,此成分在表皮蜡形成中起重要作用[47,114]。从拟南芥中鉴定出的MAH1基因编码中链烷烃羟化酶,定位在内质网上,催化由烷烃转化为次级醇和酮的反应,MAH1突变体与野生型相比次级醇和酮的含量减少,烷烃的含量增加,说明MAH1在次级醇和酮的合成过程中具有重要作用[55]。在番茄中鉴定出1个与CER1同源的基因SlCER1-1也参与催化烷烃的合成[39]。最新研究发现,在拟南芥茎蜡质生物合成中脂肪醇氧化酶3(FAO3)和FAO4b在醇和烷烃的形成途径中的均起作用[115]。

3 蜡质运输、分泌及调控机制

目前,已发现的催化蜡质合成前体VLCFAs的酶都定位在内质网上[116-117],这表明蜡质产物都是在内质网内合成的,蜡质产物最终在表皮层发挥作用。因此,在内质网中产生的蜡质、醛、烷烃、醇、酮等蜡质成分,需要从内质网中运输到植物的表皮层发挥作用。此过程需要穿过内质网膜、质膜、穿过细胞壁,最终在植物表皮上堆积组装成蜡质晶体[58]。

3.1 从内质网运输到质膜

目前对于蜡质成分从内质网到质膜的运输途径,存在着两种假说,一种是囊泡分泌假说,认为蜡质成分以小囊泡的形式,从内质网运输到高尔基体,再运输到质膜[5](图4)。第二种假说认为蜡质成分通过与质膜原生质紧密并置的内质网区域直接转运进入质膜,但是这些区域并不发生膜的融合,内质网膜和质膜之间距离大约10 nm。已有研究证明脂质可以从质膜转移到内质网膜,而无需囊泡的介导[58],因此推测,蜡质成分可通过内质网膜和质膜的紧密并置区直接进入质膜,但目前这2种假说都没有直接的试验证据,有待进一步验证。

图4 表皮蜡质运输机制Fig.4 Mechanism of epidermal wax transport

3.2 从质膜运输到细胞壁

到达质膜中的蜡质成分要转移到疏水性的质外体中,从质膜的疏水中心转移超长链脂肪酸的衍生物需要消耗能量[58]。ABC转运蛋白,即ATP结合盒式蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC),是一类利用水解ATP的能量,由2个跨膜结构域及2个胞质ATP结合域组成的转运蛋白,可以将细胞质膜上的糖、氨基酸、磷脂和肽、亲脂性药物、胆固醇和其他小分子转运到细胞外。ABC转运蛋白的一个亚基定位在质膜上,能够水解ATP提供能量,是植物中发现的能够运输脂类的依赖于ATP供能的亲脂蛋白,并直接影响了植物表皮蜡质的积累[57-59,118]。第一个从拟南芥中克隆的ABC转运蛋白由CER5编码,命名为ABCG12,定位于细胞质膜,参与植物表皮蜡质的运输[58]。CER5突变体的茎和叶表皮蜡质含量减少,在蜡质分泌细胞的细胞质中堆积了一些片状的油脂夹杂物[58]。Bird等[57]研究表明,ABCG11突变体与CER5突变体表型相似,其茎和叶片表皮总蜡质含量减少,并且ABCG11蛋白也定位于质膜。ABCG11还与营养器官中角质单体的输出有关。ABCG11可以与ABCG12结合形成同源二聚体,ABCG12运输蜡质成分到质膜需要依赖ABCG11,ABCG11能够与多种蛋白互作转运脂质化合物[57,59]。玉米Glossy13基因与拟南芥ABCG32家族基因编码蛋白高度同源,参与了蜡质向表皮细胞运输的过程[61]。Li等[91]研究发现,玉米基因Glossy6可能不仅参与蜡质在内质网中的合成,可能也在细胞蜡质运输过程中起作用,亚细胞定位发现Glossy6在高尔基体、囊泡膜、细胞质等细胞器均有表达,通过透射电镜观察发现Glossy6突变体叶片表皮细胞内积累了大量的类似CER5拟南芥突变体中的针状蜡质晶体,不能运出细胞膜外,由此推测,Glossy6是在蜡质合成、胞内运输等过程起作用。在拟南芥中,WBC11参与表皮脂质和蜡质的运输,敲除WBC11导致植株生长发育迟缓,花粉粒形状不规则以及植物表面角质和蜡质含量减少[58]。此外,植物花粉雄性不育也直接和花药蜡质积累量减少有关,蜡质转运蛋白功能的异常直接导致花药保水能力下降,导致花粉干瘪败育,花器官发育也和蜡质转运和分泌直接相关[56,60,95-97,119]。

3.3 从细胞壁到角质层

穿过质膜进入质外体的疏水蜡质成分,需要经过亲水的细胞壁基质到达植物角质层,该过程主要有2个路径,第一种路径是脂转运蛋白(lipid transfer proteins,LTPs)发挥作用,植物蜡质中最丰富的蛋白是非特异性脂转移蛋白,该蛋白对底物的结合有广泛的特异性[56,62],见图4。当疏水性的蜡质成分到达质体外后,其外分布的大量脂转运蛋白迅速与其结合,将其运输出细胞壁到达表皮外侧。关于LTPs将蜡质输送到角质层的功能已被证实[56]。在LTPG1突变体中,茎和角果表皮的C29烷烃含量减少,而叶表皮中的含量变化较小[63],另发现LTPG2与LTPG1功能相似,作用于拟南芥角质层蜡质的转运[64]。Sun等[65]研究发现,在拟南芥中超表达盐芥非特异性脂转运蛋白TsnsLTP4会增加外表皮蜡质沉积,特别是超过C27的蜡质组分,TsnsLTP4蛋白亚细胞定位于细胞壁,在转基因拟南芥中敲除TsnsLTP4,表皮蜡质沉积的数量显著减少。第二种路径是蜡质成分通过和细胞壁基质相互作用穿过细胞壁。虽然细胞壁是亲水性的,但细胞壁上的蛋白和多糖在细胞壁上形成了一个相对疏水的区域[120],蜡质等疏水性成分可以通过此区域运出细胞壁,从而在表皮积累,当蜡质积累到一定量,就可以在角质中不定形蜡质的基础上形成表皮蜡质晶体[121]。

4 蜡质合成的调控机制

植物表面蜡质的合成受到各种环境因子的影响,例如干旱等胁迫能够促进蜡质的合成等[70,72,122]。另外,在植物发育过程中,蜡质合成也具有一定的时空特异性,主要表现在不同植物种类、组织及器官表面蜡质的分布都有所不同,如:拟南芥茎秆表面的蜡质含量高于叶表面且主要由烷烃(占比38%)、酮(30%)、脂肪醇(12%)、仲醇(10%)、醛(6%)、游离脂肪酸(3%)和蜡酯(1%)组成,叶片中蜡酯含量相对较少[90]。目前对蜡质合成调控的研究主要集中在3个方面:转录水平、转录后水平及翻译后水平调控,见表4。

表4 植物表皮蜡质调控机制Table 4 Regulation mechanism of plant epidermal wax

4.1 蜡质合成转录水平调控

已有大量的证据表明,植物表皮蜡质合成可以在转录水平上被调控。WIN1/SHN1及其相似基因SHN2和SHN3,属于AP2-EREBP类型转录因子,是最早被发现与表皮蜡质合成有关的转录因子。在拟南芥中发现,WIN1/SHN1能显著上调KCS1、CER1和CER2基因的表达,它们都是编码蜡质生物合成途径的酶[68]。后来Kannangara等[123]研究发现,WIN1可以直接调控蜡质合成中编码长链酰基辅酶A合成酶的LACS2基因。在水稻中报道了拟南芥WIN1/SHN基因的直系同源基因OsWR1,OsWR1与蜡质合成基因OsLACS2和OsFAE1的启动子上的DRE和GCC元件发生相互作用从而调控其表达,是水稻中蜡质合成相关基因的正向调节因子,有助于减少植物的水分流失和增强抗旱性[70]。在番茄(Solanumlycopersicum)中发现SlSHN1基因是蜡质合成的转录激活子,过表达该基因会使GDSL脂肪酶、酰基辅酶合成酶基因的表达显著上调,进而增加番茄果皮的蜡质含量[68]。在拟南芥中过表达大豆(Glycinemax)的GmSHN1和GmSHN9基因发现,参与脂肪酸延伸过程的AtKCS1、AtKCS2、AtCER6/CUT1、AtKCS10/FDH、AtKCR1、AtPAS2、AtCER10和AtCER2基因的表达均上调,从而致使叶片表皮蜡质含量增加[29]。拟南芥中AP2/ERF型转录因子WRINKLED4(WRI4)正调控拟南芥茎秆蜡质的积累,且其他已知的2个WRI1-like 蛋白WRI1和WRI3也在拟南芥脂肪酸合成中起正调控作用。WRI4直接与LACS1,KCR1,PAS2,ECR和WSD1的启动子区域相互作用,同时还可以直接参与到蜡质前体的脂肪酸延长和蜡酯合成的调控[76-78]。Zhang等[71]在紫花苜蓿中也发现了包含AP2结构域的WXP1转录因子正调控角质层蜡质的积累,并导致紫花苜蓿的抗旱性提升,WXP1和WXP2属于AP2/EREB型转录因子,能够调控CER6和LACS2基因,在苜蓿中过表达WXP1基因,C30初级醇含量显著增加,其叶片上表皮蜡质含量也显著增加。Cheng等[69]在莎草属(Cyperusesculentus)中分离的AP2/ERF型转录因子WRI4-like转入拟南芥中也发现了同样蜡质增加的表型,莎草CeWRI4通过促进表皮蜡的生物合成和沉积,从而提高其耐旱性和干旱胁迫下的水分利用效率。这些研究表明,WIN1/SHN1在调控蜡质及角质的生物合成或积累中发挥重要作用。Suh等[79-80]报道,MYB转录因子家族成员对陆生及藻类植物蜡质的合成起着重要的调控作用。已经发现的正调控蜡质积累的转录因子占比较大[35,124];MYB16通过与WIN1/SHN1部分协同从而调控角质的生物合成和蜡的积累[66];MYB106可以正调控WIN1/SHN1的表达[66];MYB30能够通过调控KCS1/2、PAS2/HCD、CER3和LTPG1等基因的表达,参与到蜡质生物合成及VLCFAs延伸途径中,诱导VLCFAs的积累[35];MYB96转录因子表达升高,能作用于靶基因KCS1、KCS2、KCS6、KCR1和CER3,上调这些参与蜡质合成通路基因的表达[33];MYB96的同源基因MYB94具有类似的功能,通过上调WSD1、KCS2/DAISY、CER2、FAR3和ECR基因促进蜡质合成[33],MYB94和MYB96通过与蜡质生物合成基因启动子中相同的MYB共有基序结合来激活表皮蜡质的生物合成[33];过表达MYB41基因,会使其植株细胞体积变小,角质层不连续,并增加角质及蜡质生物合成相关基因转录的数量。这些结果表明,MYB41可以调控角质和蜡质的合成[67]。玉米中最早发现的调控蜡质合成的Glossy3基因,其编码1个MYB转录因子并正调控蜡质的合成[88]。Zheng等[89]曾利用玉米中已发现的蜡质突变体进行了转录组分析,以挖掘受Glossy3调控的更多的蜡质合成相关基因。

转录组学分析数据表明一些参与蜡质合成基因的表达受昼夜节律调控,蜡质的合成和积累也呈现相应的节律性变化,这种变化与AP2/ERF型转录因子DEWAX调控有关[72]。DEWAX的表达受黑暗诱导,呈现出与蜡质合成相关基因相反的表达模式。据报道,拟南芥DEWAX能够负调控LACS,如果抑制该转录因子的表达,会增加LACS的活性,从而使叶片和茎秆蜡质显著增加;若过表达该基因则会降低LACS的活性,进而减少叶蜡和茎蜡的总量。由此表明,DEWAX转录因子是蜡质合成的负调控因子[73-75]。蜡质除了具有反射光线和保水功能外,也会影响细胞的分化过程及器官分化的形态建成。Wu等[30]研究拟南芥卷叶突变体curlyflagleaf1(cfl1)时发现1个具有WW结构域(蛋白-蛋白作用模式;A Module for Protein-protein Interaction)的CFL1蛋白,过量表达该基因会导致叶片表皮蜡质合成量减少,伴随着叶片卷曲器官融合,CFL1可以直接与HDG1互作进一步正调控蜡质合成关键基因FDH/KCS10。AP2/DREB型转录因子RAP2.4与WXP1具有高度序列相似性,在干旱胁迫下,能够转录激活蜡质合成过程中的KCS2和CER1的表达,这表明RAP2.4是在干旱胁迫条件下激活拟南芥叶片中表皮蜡质生物合成的转录因子[81]。目前已有研究发现,在拟南芥和亚麻荠(Camelinasativa(L.) Crantz)中过表达WSD1可以改善拟南芥和亚麻荠的渗透胁迫耐受性,从而增强对干旱胁迫的耐受性[50]。

5 蜡质合成转录后水平调控

蜡质合成的转录因子除了在转录水平调控以外,还存在转录后水平调控。拟南芥CER7对蜡质的调控就属于转录后水平调控,CER7编码外泌体(exosome)的核心亚基,通过控制CER3的转录水平来调节拟南芥茎秆蜡质水平[83]。Lv等[84]进一步研究发现,CER7编码的蛋白具有3′→5′外切核糖核酸酶活性,能介导CER3转录物3′→5′的衰变,其衰变会引发siRNA(small interfering RNAs)的大量产生和CER3/WAX2高效的转录后基因表达沉默,表明CER7是在转录后通过RNA加工来调控蜡质合成。另外,tasiRNAs(trans-acting small interfering RNAs)能够直接作为效应分子调控CER3/WAX2水平来调控蜡质合成。在植物中存在着大量非编码小RNA,它们通过对靶标mRNA直接切割或在转录后抑制其翻译对基因表达起调控作用[124]。这些研究说明植物中非编码小RNA在蜡质合成的转录后调控过程中起着重要作用。此外,CER16通过抑制转录后CER3基因的沉默从而调节烷烃的生物合成[46]。

6 蜡质合成翻译后水平调控

蜡质生物合成调控还发生在翻译水平上,但是目前在这方面的研究较少。CER9编码一个带有RING结构域的E3泛素连接酶,可通过降解泛素-26S蛋白酶体系统从而使表皮脂质合成受损,该基因功能缺失会致使C24、C26超长链脂肪酸合成量显著增加,而醛、初级醇及烷烃等成分减少[84]。Ménard等[86]研究表明,2个编码RINGE3泛素连接酶(HUB1和HUB2)基因通过H2B组蛋白的泛素化,通过上调LACS2和CER1基因的表达,进而调控表皮蜡质的生物合成。2019年,Kim等[85]研究发现,拟南芥SAGL1介导泛素连接酶复合物在细胞质中靶向降解长链烷烃合成酶CER3,从而负调节表皮蜡的生物合成,SAGL1突变将导致严重的植株生长迟缓,耐旱性增强以及茎、叶和根中蜡的积累,SAGL1-CER3调节模式,可在不同湿度条件下维持陆生植物中表皮蜡生物合成的稳态。

7 蜡质的其他调控途径

植物表皮蜡质的生物合成及运输调控机制较为复杂,除了以上脂肪酸合成、延伸、脂肪酸之间的转换,以及蜡质在胞内的运输、转运等较为稳定的生物途径外,还有一些潜在的调控模式目前还未被挖掘。Wang等[125]发现,组蛋白乙酰化酶GCN5通过调控CER3的转录水平,从而正向调控拟南芥茎秆蜡质的合成。而Guo等[82]也发现,水稻OsCHR4基因编码1个CHD3家族染色体重组蛋白,其突变后导致水稻叶片变窄卷曲,且蜡质积累。此外,植物生长环境也直接影响到表皮蜡质的积累,且蜡质含量的多少也会影响到植物体内激素水平的变化,以及植物的生长发育。如在干旱和盐胁迫下向日葵叶片蜡质积累受到影响[98]。Takasugi等[94]发现,水稻脂肪酸延伸酶的突变体oni1中不仅蜡质含量减少,其植物生长素相关基因的表达也受到了影响。

8 结 语

已报道的植物表皮蜡质的合成途径表明,内质网中的乙酰辅酶A经过TCA循环后,经过脂肪酸的从头合成,生成C16、C18脂肪酸,在酰基还原酶的催化下,延伸生成蜡质合成前体VLCFAs,再经过酰基还原途径和脱羧途径生成蜡质主要成分。已有研究在这个过程中挖掘到了很多相关基因,如长链酰基辅酶A合成酶(LACS)类基因、酰基转移酶BAHD家族成员CER2基因、烷烃羟化酶MAH1基因等各类合成基因保证了蜡质的合成。

除了目前已知的蜡质生物合成、转运及调控相关基因外,环境条件包括光照、温度等环境因素对植物表皮蜡质的调控机理还尚待挖掘;表观遗传学水平的调控机制也有待深入研究。今后,应挖掘更多的蜡质基因,通过超表达或者基因编辑技术对蜡质进行富集,从而提高植物的耐旱、耐热、耐辐射及病虫害抵御能力。其次,蜡质也是果蔬保鲜的“秘密武器”,可延长果蔬的货架期;也可以通过提纯、合成相关产物,用于蔬果保鲜。